Nghiên cứu nuôi trồng thử nghiệm đông trùng hạ thảo trên tằm dâu tại 3 tỉnh Sơn La, Điện Biên, Lai Châu

i LỜI CẢM ƠN T ự ệ ề , ợ ự ỡ ớ ủ ể ủ ệ V T - ọ ộ ế ớ ự ỡ ủ ọ ự ỡ ề ủ ọ ệ – TS. ù T Tù ( Y ợ , ọ ộ ); T ể k Y ợ , ọ ộ , V ệ ợ ệ - ộ Y ế, ọ ợ ộ , V ệ T ự ẩ ứ , Biotrade - T T ể T S ọ V ệ , ổ ầ ợ , ợ khoa DK Pharma, TS V ( , , U ), ù ể ỡ ề ệ ợ ự ệ ề X ợ ọ ự ỉ ị , ề ệ ỡ ủ ể ở , ở ệ T T, ở Y ế ở ó 3 ỉ S , ệ X ọ ể ệ , ọ ệ T, T SV ù ị ứ T ỉ ị , ề ệ ỡ ề ủ ụ , ở ự ể ề ự ệ ợ ề ợ ự ủ ộ, ỡ ệ ọ ề ệ ợ ủ ủ ệ , ể , ộ S - , ọ T ; Sự ỡ ủ ộ ề ể ệ ự ệ ề q ý á ó! S La, á 9 ăm 2017 & 76. 3 ạ 9ă 1 mii MỤC LỤC MỞ ẦU ........................................................................................................................................ 1 2 ụ ứu .................................................................................................... 3 3. Nộ ứu ................................................................................................... 3 PHẦN 1: TỔNG QUAN .............................................................................................................. 4 1 1 Tổ ề ù .................................................................. 4 1.1.1. ớ ệ ................................................................................................................... 4 1 1 2 ặ ể ọ ủ Cordyceps militaris ........................................................ 6 1 1 3 ị ợ ệ ủ Cordyceps militaris ................................................................... 9 1.1 4 ứ ồ C. militaris ế ớ V ệ ................................ 12 1.2. ặ ể ự , ế, ộ ủ ệ , , S ............................... 18 1.2.1. Tỉ ệ .................................................................................................................... 18 1 2 2 Tỉ ...................................................................................................... 20 1.2.3. Tỉ S ........................................................................................................................ 23 PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................ 29 2 1 V ệ ứ , ó , ế ị .................................................................................. 29 2 1 1 V ệ ................................................................................................................................ 29 2 1 2 ó ết bị ............................................................................................................. 29 2 2 ứ ....................................................................................................... 29 2 2 1 ề , .......................................................................................... 29 2 2 2 ó ực nghiệm ...................................................................................... 30 2 3 T í ệ ...................................................................................................... 47 2 3 1 T ệ ................................................................................................................. 47 2 3 2 X í ệ ........................................................................................................................ 48 PHẦN 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN ....................................................... 49 3 1 Ặ IỂM CỦA NẤM C. militaris NBRC 100741 ..................................................... 49 3.1.1. ế ứ ặ ể ể ủ C. militaris NBRC 100741 ........................................................................................................................................................ 49 3.1.2. Kết qu t ó ếu t ở ến t o nguồn gi ng n m C. militaris cung c ù th ữ gi ng ..................................................... 52 3 1 3 ĩ ............................................................................................................ 57iii 3 2 ẾT UẢ IÊ ỨU XÂY Ự UI TRÌ UÔI TRỒ Ấ C. militaris Ở UI Ô Õ T Í IỆ ...................................................................... 59 3.2.1. Kết qu ứ ở , ển của n m C. militaris ể bột nhộng tằm .................................................................................................................................................. 59 3.2.2. Kết qu t ếu t ở ến sự ở ển của n m C. militaris ể tự ( ằm/nhộng tằ )............................................................... 82 3.2.3. Kết qu ịnh th ểm thu ho ù th o C. militaris ............................................................................................................................................... 98 3 2 4 ồ ùng h th o C. militaris ở í ệm .... 104 3.3. KẾT QUẢ IÊ ỨU XÂY Ự UI TRÌ UÔI TRỒNG NẤM Cordyceps militaris NBRC 100741 Ở UI Ô I T ......................................................... 108 3 3 1 ng n m NBRC 100741 C. militaris NBRC 100741 ể ........................................................................................................................................ 108 3.3.2. Sự ở ển của NBRC 100741 ở pilot sau khi xu t hiện thể qu t i í ệm ........................................................................................................................ 108 3.3.3. Sự ở ển của NBRC 100741 ở ện hệ sợi t í ệm ............................................................................................................. 113 3.3.4. Sự ở ển của NBRC 100741 ở y gi ể t í ệm ....................................................................................................... 117 3.3.5. ù th o Cordyceps militaris ........................... 121 3.4. IÊ ỨU XÂY Ự UI TRÌ UÔI TRỒ Ấ C. militaris Ở UI Ô Ộ I Ì ................................................................................................................... 125 3 4 1 ễ ế ế ừ 10/2015 - 9/2016 ị ể ứ ........................ 125 3 4 2 ng n m Cordyceps militaris R 100741 y NBRC 100741 ể bột nhộng tằm .............................................................................................................................. 128 3.4.3. Sự ở ển củ ù th o NBRC 100741 t ộ ể qu t i PTN ............................................................................................ 128 3.4.4. Sự ởng củ ù th o NBRC 100741 t ộ thiện hệ sợi ở í ệm ................................................................................................. 134 3.4.5. Sự ởng ển củ ù th o NBRC 100741 t i hộ khi c y gi ể ở PTN ................................................................................................. 137 3 4 6 T ể ồ ù ợ ù ...................................... 143iv 3 4 7 ồ ù th o Cordyceps militaris ộ ... 143 3.5. IÊ ỨU XÁ Ị T À Ầ , À ƯỢNG MỘT SỐ CHỈ TIÊU I ƯỠ VÀ ỢP CHẤT Ó ẠT TÍ SI ỌC CỦA SẢN PHẨ Ô TRÙ Ạ THẢO C. militaris NBRC 100741 ..................................................................... 147 3 5 1 ợ C. militaris NBRC 100741 ............... 147 3 5 2 ợ C. militaris NBRC 100741 .................................... 149 3 5 3 ợ ộ é C. militaris NBRC 100741 ............................. 151 3 5 4 ợ , , β C. militaris NBRC 100741 ...................................................................................................................................................... 152 3 5 5 ợ ộ C. militaris NBRC 100741............. 153 3 5 6 ợ C. militaris NBRC 100741 .............................................. 154 3 5 7 ợ C. militaris NBRC 100741 .......................................... 155 3.6. HIỆU QUẢ KINH TẾ, KHẢ Ă TRIỂN KHAI ỨNG DỤ UI TRÌ UÔI TRỒNG NẤM C. militaris TRÊ IÁ T Ể TỪ NHỘNG TẰ ÂU TẠI SƠ , IỆN IÊ , I ÂU ...................................................................................................................... 155 3 6 1 ầ ................................................................................................ 155 3 6 2 ề kh ụn ........................................................................ 157 3 6 3 ề thị ng ...................................................................................................... 158 3 6 4 ệu qu kinh tế ................................................................................................. 159 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................................ 163 1. Kết lu n .................................................................................................................................... 163 2. Kiến nghị ................................................................................................................................. 164 TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................................... 165v DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1. Ả ởng củ ế ởng, ển của n m C. militaris .................................................................................................................................... 52 Bảng 3.2. Ả ởng củ ến sự ển của n m C. militaris .................................. 54 Bảng 3.3. Ản ởng của nhiệ ộ ế ởng của n m C. militaris ........................... 56 Bảng 3.4. ợ t bổ ể bột nhộng tằm .......................................... 69 Bảng 3.5. T ầ ể y n m C. militaris ....................................... 70 Bảng 3.6. ặ ểm hệ sợi n ể 5 y ........................... 70 Bảng 3.7. ể ủ ể 45 ồ ....................................................................................................................... 72 Bảng 3.8. Ả ởng củ ộ ẩm tới kh ể qu của n m C. militaris ể bột nhộng tằm .................................................................................................................. 74 Bảng 3.9. Ả ởng của nhiệ ộ tớ ở , ển của của n m C. militaris ể bột nhộng tằm .................................................................................................................. 76 Bảng 3.10. Ả ởng củ è è ởng, ển của thể qu n m C. militaris ể bột nhộng tằm ........................................... 78 Bảng 3.11. Ả ởng củ ộ ự ở , ển của thể qu n m C. militaris ể bột nhộng tằm ........................................................................................ 81 Bảng 3.12. Ả ởng củ ứ ễm n m C. militaris ế ở , triển của nhộng/tằ ............................................................................................................... 83 Bảng 3.13. Ả ởng tuổi của nhộng tằ ến việ ể qu n m C. militaris.... 88 Bảng 3.14. Ả ởng của nhiệ ộ tới kh ở , ển thể qu ợng adenosin, cordycepin của n m C. militaris ộng tằ ................................ 90 Bảngng 3.16. Ả ởng củ ộ ẩm tới kh ể qu của n m NBRC 100741 ộng tằ ......................................................................................................... 92 Bảng 3.17. Ả ởng củ è è ng93 ự ể qu của n m NBRC 100741 ộng tằ ..................................................... 93 Bảng 3.18. Ả ởng củ ộ ự ể qu của n m NBRC 100741 ộng tằ ........................................................................................................ 95 Bảng 3.19. Ả ởng của gi ng tằ ến kh ể qu n m NBRC 100741 ........................................................................................................................................................ 96vi Bảng 3.20. ợ in trong thể qu NBRC 100741 nhộng tằm é ộng tằ é ................................................................................................ 97 Bảng 3.21. Chiề ng của thể qu C. militaris ở ể ởng ...... 98 Bảng 3.22. ợ ể ở ể ở ....................................................................................................................................... 99 Bảng 3.23. Sự ổi kh ợ , í ớ , c của thể qu NBRC 100741 sau khi s y trong tủ s ( ) ........................................................................... 100 Bảng 3.24. ợ ể qu của n m C. militaris theo y trong tủ s ............................................................................... 102 Bảng 3.25. ợ ể R 100741 ....................................................................................................................................... 103 Bảng 3.26. Sự ổ ợ ể ù ớ ề ệ ế .......................................................................... 103 Bảng 3.27. ặ ể ở , ển của n m C. militaris NBRC 100741 ở pilot sau khi xu t hiện thể qu t í ệm ................................................................ 109 Bảng 3.28. ặ ể ở , ển của n m NBRC 100741 ở lot sau khi ện hệ sợi t í ệm ...................................................................................... 113 Bảng 3.29. ặ ể ở , ển của n m NBRC 100741 ở c y gi ể t í ệm ................................................................................ 117 Bảng 3.30. Diễn biến th i tiết từ 10/2015-9/2016 t ị ể í ệm ........... 126 Bảng 3.31. ặ ể ởng của thể qu ù th o C. militaris NBRC 100741131 t i hộ t hiện thể qu t i PTN ............................................ 131 Bảng 3.32. ặ ể ởng củ ù th R 100741 thiện hệ sợi ở PTN .................................................................................................................... 135 Bảng 3.33. ặ ể ở , ển củ ù th o NBRC 100741 t hộ y gi ể ở PTN ...................................................................... 140 Bảng 3.34. T ầ , ợ t ch ó ể qu ể Nhiệ ộ tự , o ............................................................................................................ 142 Bảng 3.35. ợ ệ ợ ể C. militaris NBRC 100741 ề ệ í ệ ....................................................... 147 Bảng 3.36. ợ ệ ợ ể C. militaris ở ề ệ í ệ ....................................................................................................................... 150vii Bảng 3.37. ợ é ệ ợ ể C. militaris ở ề ệ í ệ ....................................................................................................................... 151 Bảng 3.38. ợ , , β ệ ợ ể ủ R 100741 ở ề ệ í ệ ............................................................. 152 Bảng 3.39. ợ ộ ệ ợ ể C. militaris R 100741 ề ệ í ệ ....................................................... 153 Bảng 3.40. ợ ệ ợ ể C. militaris NBRC 100741 trong ề ệ í ệ c nhau ........................................................................................... 154 Bảng 3.41. ợ ệ ợ ể C. militaris NBRC 100741 trong ề ệ í ệ ........................................................................................... 155 Bảng 3.42. í ầ ự ồ T T t i 3 tỉnh S , ệ , ................................................................................................................... 156 Bảng 3.43. Tổng hợ ề kh ụ ồ T T i 3 tỉ S , ệ , .............................................................................................. 157 Bảng 3.44. Hiệu qu kinh tế củ ồ T T ( VT: V ồng) ........... 160 Bảng 3.45. Hiệu qu kinh tế củ ồ T T ự ( VT: V ồng) ..... 161 Bảng 3.46. Tổng hợ ệu qu kinh tế ứng dụ ồ trồng n m Cordyceps militaris t i 3 tỉ S , ệ , ................................. 161viii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. m Cordyceps militaris ặ ọ ể ứ ........................... 6 Hình 1.2. ủ Cordyceps militaris ............................................................ 8 Hình 2.1. S ồ b í í ệm ở ...................................................................... 43 Hình 2.2. S ồ ớc tiế í í ệ ồng C. militaris ộ gia ................................................................................................................................................. 44 Hình 3.1. nh cu ( ) của n m C. militaris (B) ....................... 49 Hình 3.2. Kết qu ện di s n phẩm PCR rDNA của C. militaris NBRC 100741 .................. 50 Hình 3.3. ế ự 5,8S ủ R 100741 ớ ..................................................................................................................... 51 Hình 3.4. Vị í ủa chủng n m C. militaris R 100741 i .................... 51 Hình 3.5. Biể ồ í ớc khuẩn l c n m C. militaris ng ....................... 52 Hình 3.6 ẩn l c n m C. militaris (A) c t do hệ sợi n m C. militaris (B) ế ng (Tỉ lệ: 60mm) ............................................................................. 53 Hình 3.7. Biể ồ í ẩn l c n m C. militaris ở d i pH 4-9 ................................. 54 Hình 3.8. S c t do hệ sợi n m C. militaris ế ở ộ .............................. 55 Hình 3.9. í ẩn l c n m C. militaris ở ệ ộ .......................... 56 Hình 3.10. í ớc khuẩn l ( ) c t do hệ sợi n m C. militaris tiết ra (B) ở nhiệ ộ (Tỉ lệ: 50mm) ................................................................................................ 57 Hình 3.11. ĩ C. militaris ( ) ệ ( ) ............. 58 Hình 3.13. í ớc của khuẩn l c n m C. militaris ở ợ ...... 60 Hình 3.14. Kí ớc của khuẩn l c n m C. militaris ở ợng cao n nhau ................................................................................................................................................ 62 Hình 3.15. Ả ởng củ ợng cao n ến sự ởng của hệ sợi n m C. militaris (tỉ lệ: 50mm) .............................................................................................................. 62 Hình 3.16. Kí ớc của khuẩn l c n m C. militaris ở ợ ..... 63 Hình 3.17. Ả ở ủ ợ ế ự ở ủ ệ ợ C. militaris (tỉ lệ: 50mm) .................................................................................................................................. 64 Hình 3.18. Ả ởng củ ợng MgSO4.7H2 ến sự ởng của hệ sợi n m C. militaris ...................................................................................................................................... 65 Hình 3.19. Ả ở ợng KH2PO4 ến sự ởng của hệ sợi n m C. militaris ... 66ix Hình 3.20. Ả ở ợ 1 ến sự ởng của hệ sợi n m ................ 67 Hình 3.21. Ả ở ợng nhộng tằ ến sự ởng của hệ sợi n m ....... 68 Hình 3.22. ẩ ủ C. militaris ở ợ ộ ................ 68 Hình 3.23. Hệ sợi n t ở ể bổ sung thể í 30-50 ng .... 71 Hình 3.24. Hệ sợi n t ở ể bổ sung 60-80 ng ................. 72 Hình 3.25. Hệ sợi n t ở ể bổ sung 90-100 ng ............... 72 Hình 3.26. ể qu 45 ồng ......................... 73 Hình 3.27. ể ể qu 45 ồng................................ 73 Hình 3.28. S ởng của thể qu n m C. militaris ở ộ ẩm ể bột nhộng tằm ..................................................................................................................................... 74 Hình 3.29. ớc t ộ ẩ ồng t o thể qu C. militaris ........................... 75 Hình 3.30. S ởng thể qu n m C. militaris ở nhiệ ộ ể bột nhộng tằm ...................................................................................................................................... 77 Hình 3.31. S ợ í ớ ể ới ởng củ ộ ớ ó ................................................................................................................................................ 79 Hình 3.32. S ởng của thể qu n m C. militaris ớ ng ộ ể bột nhộng tằm.................................................................................................................... 80 Hình 3.33. Tằ ù ị nhiễm vi khuẩn, n m m .......... 84 Hình 3.34. ĩ y n m C. militaris ộng tằ .......................................... 85 Hình 3.35. S ởng của n m C. militaris ằ ù ........................................ 86 Hình 3.36. S ợng thể qu C. militaris ộng tằ ợ ễ 2 ức ( ) ( ) .................................................................................................................... 87 Hình 3.37. Thể qu n m C. militaris ộng tằ ở ổ c nhau ............ 89 Hình 3.38. Thể qu n m C. militaris ộng tằ ở d i nhiệ ộ 7 - 30oC ................ 90 Hình 3.39. Thể qu n m NBRC 100741 ộng tằ ở ộ ẩ ......... 92 Hình 3.40. S ởng của thể qu n m NBRC 100741 ộng tằ ồng ều kiệ è ( ) è compact (B) ................................ 93 Hình 3.41. Thể qu n R 100741 ộng tằ ồng ở ộ ....................................................................................................................... 94 Hình 3.42. ộ ằ é ( ) ộ ằ é ( ) ............................. 96 Hình 3.43. Thể qu NBRC 100741 khi thu ho ch ..................................................................... 99 Hình 3.44. ù th o NBRC 100741 xế y ................................... 100x Hình 3.45. ù th y truyền th ng (A) ( ) ...................................................................................................................... 101 Hình 3.46. S ẩ ù ợ ó ó . 102 Hình 3.47. ù ế ổ 30 ề ệ ế ... 103 Hình 3.48. Hệ sợi C. militaris R 100741 ể bột nhộng tằm ở pilot ................ 120 Hình 3.49. Sự xu t hiệ ể qu NBRC 100741 từ hệ sợi ở pilot .................................... 120 Hình 3.50. Kh ợng củ ể qu NBRC 100741 (lớn nh t – nh nh t) ở pilot .......... 120 Hình 3.51. Kh ợng thể qu R 100741/ ở pilot ................................................... 120 Hình 3.52. í ớc thể qu NBRC 100741 ở pilot khi thu ho ch .................................... 121 Hình 3.53. S ợ í ớc thể qu R 100741/ ở pilot ............................... 121 Hình 3.54. ể qu NBRC 100741 ở pilot ............................................................... 121 Hình 3.56. Sự xu t hiện thể qu từ hệ sợ ( ỉnh t T ) ều kiện nhiệ ộ tự , o/tự ở th ể X ................................ 134 Hình 3.57. Sự xu t hiện của hệ sợ ều kiệ í ệ ............................ 138 Hình 3.58. c thể qu ều kiệ í ệ ................................. 139 Hình 3.59. ng thể qu ều kiệ í ệ .............................. 139xi DANH MỤC CÁC THUẬT NGỮ VIẾT TẮT Kí hiệu Chữ viết đầy đủ C.militaris Cordyceps militaris C. sinensis Cordyceps sinensis T T T ù T CDA Czapek- Dox agar CZYA Czapek Yeast Extract agar MCM Schizophyllum Genetics Complete Medzum plus Yeast Extract MPDA Martins Peptone Dextrose agar PDA Potato – Dextrose agar SDA Sabouraud Dextrose agar SDAY Sabouraund Dextrose agar plus Yeast Extrac1 MỞ ẦU ù th o Cordyceps militaris ộ ù ó ợc liệ ự m Cordyceps sinensis ợ ụ ề trong y học cổ ề C ụ í ủ ị ế ũ ợ ứ khoa ọ ệ ỉ ra : ế ở cao ế ; ệ ợ ế ở tim; ụ ủ ợ ớ ; ệ trong ợ ặ ổ do ế ; ự suy ủ , ế ệ sinh ụ ồ ế ể ở ; T ị ế trong í ừ ; cholesterol trong ữ ộ ; X ế ụ ủ ộ ế , ẩ ế ế ra insulin; ữ ổ ị ị ủ tim; T ễ ị ặ h ệ … T í, ù ó ụ ó ủ ể, ế ệ ủ ổ , ó ụ ệ ầ , y ọ ệ ù ó ụ ứ ế ự ẩ lao õ ệ ù ó ụ cao ứ ễ ị ủ ế ó ệ ề ị ị ớ ệ gan B, ặ gan (Seulmee et al., 2009; Shonkor, 2010) ù ệ ó : T ù ( ự ) ù ( ) ứ ự , ệ ế ứ ự ộ ó ể ớ T ứ ằ ợ ự ệ í ệ ớ ữ ế ị ệ ớ Cordyceps sinensis với s ợng r í ỉ mọc trong tự , Cordyceps militaris ó ể ợ ồ ề ệ o. ệ ề ộ Cordyceps ợ ồ ệ ể ế ó ợ í ẩ ự ẩ ứ ừ Cordyceps militaris c ế ị ớ ế ớ thi ủ ẩ ty Zeolite 41,95USD/ ọ 90 (650 / ), Cordygen 19,95 US / ọ 90 Ở V ệ Nam, T ế ĩ Khoa ọ Duy Ban ù khoa ọ uy í ty Daibio ra T ù T V ệ2 Nam ể ể T ù T Daibio. Viện Di truyề ệp Việ ũ ù th o bằ m C. militaris ặc biệ , n xu ù th o (n m C. militaris C. takaomontana ó í C. sinensis) ằ ủa T ứu Thực nghiệ ệ ồng t i B o Lộ t t - mở ra mộ ớ ớ ầy triển vọng ồng trong việc s n xu ợc liệ ện rộng. T ự ó ề ặ ể ự ợ ệ ồ ế ế ệ , ệ , ợ ệ , ệ … V ệ ể ồ ợ ệ ự ở , ồ ó ủ ị é ể ề ệ ó ệ ế ó ụ ế , … ằ ề ổ ế ở ồ ộ ề T , í ừ é ộ ù ó ể ợ ằ C. militaris sinh ở ằ - ợ T í ở ộ ù ủ S , ệ , ù ợ ớ ở ủ ù ( ệ ộ 23-25o ) ề ệ ồ ớ ồ , ệ ù ằ ị ợ ệ , ị ế ủ ệ Cordyceps militaris ở ớ , ệ ể ứ ề ồ Cordyceps militaris ằ , ứ ầ ủ ớ ể ể ợ ế ị ế ứ ầ ế X ị ự í ợ ồ ù ằ ỉ S , ệ , ỉ ợ í ế ( ợ ù ợ ớ ụ , ị , ặ ệ ổ ị ị ), ó ị ọ ( ổ ồ ớ , ự ) ồ ở ộ ù ệ ợ ệ ó ị ự , ó ầ ộ . Vớ í , ự ệ ề ―1g r Fứu uô rồ g ử g Đô g rù g ạ ảo rr ằ Gâu ạ 3 ỉ 6ơ /a, Đ % r , /a & âu” ế ứ ầ ế , ó ó ự ể ủ ự T3 2. M ti u nghi n ứu (1) X ị í í của ù th ằ i 3 khu vực ở ỉ S , ệ , (2) X ự nghiệ ồ ù th o t i 3 tỉnh S , ệ , o s n phẩ ù h th ó ợ chuẩn của WHO-GACP. (3) ệu qu kinh tế ển khai ứng dụ n xu t ù th o, từ ó ề xu t kh ể ổi sinh kế ển kinh tế - ội t i một s ị ù T y B c. 3. Nội dung nghi n ứu Nội dung 1. ứ ở ọ ệ ồ C. militaris ể ự ớ ộ ủ Nội dung 2 ứ ề ị ự ó ề ệ ự í ợ ồ C. militaris ằ 3 ỉ S , ệ , Nội dung 3 ứ ự ng n m C. militaris ở qui í ệm. Nội dung 4 ứ ự ồng n m C. militaris ằ 4.1. ứ ự ồng n m C. militaris ằ í ệm 4.2. ứ ự y n m C. militaris ằ ở qui i khu vự ợc lựa chọn 4.3. ứu n ồng th nghiệm n m C. militaris ều kiện tự vớ ộ i khu vự ợc lựa chọn. 4.4. ứ ự o qu ù th o Nội dung 5. ứ ị ầ , ợng một s chỉ ti ỡng, ho í ọc của s n phẩ ù th ợc Nội dung 6 í , ệ ế ủ ; ể ứ ụ C. militaris ằ 3 ị ợ ự ọ4 PHẦN 1. TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về Cordyceps và ông trùng hạ thảo 1.1.1. Giới thiệu hung Cordyceps ọ ủ ộ ( ), ồ 300 ợ ( ) ọ Cordyceps ề í ù ( ủ ế ù ) ộ ộ ớ ( ) ộ ở Á Ö ớ ù Á, ở T , , T ề T , V ệ T ), ặ ệ ổ ế ở ặ ể ừ 3 000 ế 5 000 : T T , Tứ X , T , T , V ỉ ở T 60 Cordyceps ở ể ừ ớ ệ ớ ẩ ớ ứ ộ ớ ó ề í , ổ Beauveria (B. bassiana), Metarhizium Isaria ợ ế ế ề ớ ứ ụ ể ọ ớ ị ù T , ị Y ọ ổ ề Cordyceps sinensis ( ) S Cordyceps militaris ( F ) ợ ứ ề ề ự ẩ ứ Cordyceps sinensis ( ệ Ophiocordyceps sinensis – , í ị ủ ù , ứ ụ Cordyceps sinensis) ợ ù è ớ ể ọ ể ủ Thitarodes baimaensis ặ Thitarodes armoricanus , 46 ộ Thitarodes ũ ó ể ị Cordyceps sinensis ợ ọ ặ ể ở ù ( ù í ù , ù ầ ể , ) T ự , Cordyceps sinensis ỉ ợ ở T T , ó ộ 3800 ệ ộ ù è ớ 21o ề Thiarodes ị ễ ( , ỗ ể, ế ể …) T , ù ằ ệ ộ í ợ ự ở ể ủ V ù , ầ è, ệ ộ ầ , Cordyceps ầ , ế ỡ ủ ể ở ể , ể , ằ ặ , T ể ứ ề ữ í ở , ặ ề ệ ộ ẩ ẽ , ầ ở í5 ồ ễ ể ớ S , ộ ợ ị ó ề ị ệ ợ ệ , ù ỉ ớ C. sinensis Cordyceps í ù ợ ứ ụ ọ ( , 2013) Cordyceps militaris ( S ) ũ ợ ụ ọ ổ ề ủ T ộ ớ Á ó ể 7 , ụ, , ầ ể ứ ó ề ặ ị T , ộ 4μ ợ , ẻ ặ í ù ộ ủ ớ ớ ổ ế ệ , C. militaris ợ ứ ề ó ầ ọ ệ ệ ợ ế ớ (Huang et al., 2010; Dong et al., 2013) S ớ C. sinensis, C. militaris ợ ứ ụ ộ ề ặ í ó ồ ủ í , ặ ù ị ẩ C. sinensis ị ĩ ộ C. militaris ự ỳ ớ , ứ ợ ầ ủ ọ ế ớ Cordyceps takaomontana Yakush. & Kumaz. 1941, ợ ủ ủ ể ủ ộ ừ ợ 2-5 μ , ề , ề T ể ợ ẻ ặ ụ , ù ớ í ớ ừ 1-4,5 ớ ầ ữ í 2-20mm, ộ 1,5-3,5 ầ ừ 7-25 , ó ể ừ ớ ở ; ề ặ ẵ C. takaomontana ớ ũ ợ ứ ứ ụ ọ , ự ẩ ứ (http://cordyceps.cgrb.oregonstate.edu/node/5688). Vai trò ủa đông trùng hạ thảo Từ nay, Naxi, Lisu ộ ộ ở T T , Trung ế ụng ù ể ệ ị ự , ể ề ị ế canxi, ó (cho ẻ em), ệ ể ệ , ể ứ , ệ ễ ị ầ ở Sikkim ụ C. sinensis ể ữ 21 ệ ung , hen ễ , ệ lao, ệ ể , ho , ứ ở nam ớ ề ệ í ữ, gan, ệ ể , da, gan do ợ ữ ệ …T , vai ủ ù o ở ổ ế ế ớ ợ bao ế khi6 khi hai ữ ộ Trung ỷ ụ ế ớ trong ộ dung ề kinh 1.500, 3000 10.000 é ở Stuggartt 1993 ề ụ í í ị Trong ế ộ ệ ủ , ộ ó ụ ù (Winkler, 2005; Panda Swain, 2011). ù ợ ụ ự ẩ ợ ẩ Hoa ỳ ộ ự ẩ ợ an (GRAS). Cho ớ nay, ề coi ù ộ ự ẩ (superfood) ó ể ợ ụ trong ầ ế ế ộ (Miller, 2009). 1.1.2. Cá đặ điểm sinh họ ủa nấm Cordyceps militaris 1.1.2.1. 3 â oạ ô ả &orG FH a Cordyceps militaris ộ ọ , ợ 1753 ớ ọ Clavaria militaris ( , 1982) F ọ ề ợ ổ ủ Ướ í ó 400 ( , 1958; Kobayasi et al, 1982; Stensrud et al., 2005). Cordyceps militaris ộ ớ , , ớ S , ộ , ọ , C. militaris. T ọ Cordyceps militaris(L.) Fr. (1818) (Kobayasi et al, 1982). ù Cordyceps militaris ớ ớ , ó , ề 8-10 ầ ể ó T ể ừ ù ặ ộ , ặ ể ó , ỗ ở ữ ( 1.1) ừ 300-510 μ , ề ộ 4 μ ợ , , í ớ 3 5-6 × 1- 1 5 μ ề ệ è ỡ ẽ ứ ồ ứ ó ộ , ở , Â Á ( , 2008) Hình 1.1. Nấm Cordyceps militaris và mặt ắt dọ thể quả hứa á ào t (Christian et al., 1837)7 ộ ợ ổ ỡ ộ C. militaris W , è ở , ề S Y S Y (S , 2006) ẩ ộ ừ , , ế ù ầ ỡ ó ổ ẩ ó (Shretha et al, 2006). 1.1.2.2. & u r g F a &orG FH ar ầ ế , C. militaris ộ ù ù ủ ù ủ ế ễ ở ộ ủ ớ , ồ ể ủ ù ó ủ, ó ừ ầ ó ể ế , , ủ ủ ể S ó ợ ỡ ở ẽ ế ộ ể ế ủ ế è ặ , ể ể í ( , 1982; , 2012) ể C. militaris ó ặ (Z , 2011) Cordyceps militaris ó ủ ( nh 1.2). Ở ề ệ , ự ũ ự ệ , ệ ặ ồ 1.1.2.3. . F Cordyceps militarisis ợ ứ ủ ( , 1941) Sự ề í ủ ở ề ó ể ế ó ặ ở ề ù ị ( , 1941; , 1958; S S , 2004) ủ ổ ế ủ C.militaris trong ự ồ ù ộ ủ ớ , ó ủ ù ộ ộ ứ ( ), ộ ( ) ộ ( ), v ụ Ips sexdentatus, Lachnosterna quercina, Tenebrio molitor ( ộ ộ ứ ), Cimbex similis ( ộ ộ ) Tipula paludosa ( ộ ộ H ).8 T ự ó ề ó ự ặ ầ C.militaris, ồ C. cardinalis G.H. Sung & Spatafora, C. kyusyuensis A. Kawam., C.pseudomilitaris Hywel-Jones & Sivichai, C. rosea Kobayasi & Shimizu, C. roseostromata Kobayasi & Shimizu, C.washingtonensis , ộ (S S , 2004; S , 2007; W , 2008) Hình 1.2. Cá dạng ào t ủa nấm Cordyceps militaris (Zheng et al., 2011) a a m a a m F - q a q a a F a m a á m a M a 1.1.2.4. 7 o F G ru F F a &orG FH ar ế ó ộ ứ ề ế ọ ề ủ C. militaris T (1964) ằ ế ự ế ỡ í ệ ó 7 ễ ể, í ớ ễ ể ộ 2,0 5,7 (W , 2010) T , ứ ầ ộ ầ ủ C. militaris ó ề 32,2 (Z , 2011) ế í ó ự ệ ề ể ữ ủ ủ ó ( , 2003, 2007) T , ự ể ề ủ O. sinensis (Z , 2009), ề ủ C. militaris ừ ự ự ỳ ự ự ITS ( 2 ≤0 01) (Wang et al., 2008).9 ề ệ ở ế ự ủ ầ ủ C. militaris ợ ứ ộ ( , 2008; , 2009; Z et al., 2009; , 2011) ộ ứ ộ ế ằ ứ C. militaris ó ể ộ ế ó ặ ể ợ ộ ớ ứ , ợ , , ặ ể ( , 2004; Z et al., 2007; Zhou et al., 2009; Li et al, 2011). ự ự ể ệ T ( ST) ở C. militaris ệ ợ , ứ , ể ặ ộ ằ (X , 2010) í ể ó ế , ể ó ợ ứ ũ ị ế ữ (X , 2010) ề ứ ứ ó ự ở ủ ề ệ ế ệ ể ợ ể ó ( í ụ, , ), ở ề í õ ( et al., 2011; He et al., 2011). 1.1.3. Giá trị dƣ iệu ủa nấm Cordyceps militaris 1.1.3.1. & F a F F a &orG FH ar T ệ ứ ề ầ ó ọ ủ ể C.militaris ứ ầ ế 40,69%; : (34,7 mg/gam), vitamin B1 (13,0 mg/gam), vitamin B6 (62,2 mg/gam), vitamin B12 (70,3 / ), 3 (42,9 / ); : S (0,44 ), Z (130,0 ppm), (29,15 ); ợ ó ọ ó ợ ọ : (1,52%), cordycepic acid (11,8%), polychaccaride (30%) (Shih et al., 2007). Trong thể qu Cordyceps militaris ó ứ ợ ổ (69,32 mg/g ể 14,03 / ) ợ ỗ ể ũ ó ự ệ , ộ ừ 1,15 - 15,06 / 0,36 - 2,99 / T ầ ủ ỗ lo i trong thể qu ba ồ : (15,06 / ), (8,79 / ), (6,68 / ), (5,99 / ), (5,29 / ), (5,18 / ) ể qu . S liệ í ủ et al. (2001) cho th y phần lớn trong sinh kh i n m chứa acid aspar (2,66 / ), (2,21 / ) (1,57 / ) (Chang, 2001).10 T ể Cordyceps militaris chứa nhiề é , ế 70% ổ s é , ó ợng acid linoleic chiế ến 61,3% trong thể qu 21,5% trong ợ é ủ yế , ế 24,5% ể qu 33,0% ( , 2008). ợ ó ợ í ủ Cordyceps militaris. ế 0,18% trong thể qu 0,06% i n ớ hợ , ể qu ó ợ 3 ầ ớ (0,97% ớ 0,36%) ( et al., 2008). Polysaccharide S-1 S-2 ợ ế ừ C. militaris ó ầ ừ , ế ứ ó ụ ồ ổ , ụ ề ù ết xu t. Yan et al. (2008) ằ ụ ó ể ứ ó ủ polysaccharide từ n m. 1.1.3.2. 7 F Gụ g F F a &. ar ợ ợ ệ ủ Cordyceps militaris ứ ụ ề ệ ứ , ó ó ế Cordyceps militaris ế ự V , ệ ở ớ ế ừ ụ ụ ứ ề ệ ừ Cordyceps militaris ệ ộ ề ế * ợ : ợ (3 - ) ừ ó í , , ừ , ề ễ ị (S et al, 2010). * ó : ứ ợ -hs- S2 ứ ị ế C.militaris ó ự 1,1- -2- ( ), ứ ở ồ ộ (8 / ) 89%, 1,188 85% (Fengyao et al., 2011). * T ợ ù : ứ ợ ù ế ẩ ừ Cordyceps militaris, ợ ù , ầ ù ộ11 ệ ợ 2 ầ ụ ế ẩ ợ ế ụ ế ẩ ó ợ ị ợ ù ở ( , 2007) * ế : ( S) ế ừ Cordyceps militaris ồ ầ ó ứ ụ ề ó ầ ề ộ ễ ị ủ ự (Y , 2007) * ẩ , : C.militaris ( ) ế ừ C. militaris ó ớ 12 , I 5,1 ó 7-9 ứ ế Fusarium oxysporum ộ ớ ế b ( -T , 2009) ợ ẩ ợ ừ ợ ợ ứ ụ ệ ề ệ ễ ẩ ộ (Y -Joon et al., 2000). ự ể ệ ủ T2 (T 2 ) ị ệ ề ệ ể ệ ứ ế ứ ứ ụ ộ F- , ó ợ ọ ẽ ứ ụ ợ ộ ề ễ ù ề ệ ề ễ ị (S , 2009) * T ế : ợ ế ế ừ Cordyceps militaris ó í , ó ế ệ ủ ó ụ ề ị ế ự ế ừ ó ể ở ớ ẽ ộ ế ữ ệ ệ ợ ụ ệ ó ở ( -Sung et al., 2006). * T : ể ị ụ ủ , ị ế ừ ể Cordyceps militaris (CMWE - hot water extract from Cordyceps militaris ) ợ ệ ề ụ ể ( S) ( ị ệ ệ ), ệ ó í ế α (T F-α - -α) -6 (I -6) ủ ế R W 264 7 ự ợ ớ ồ ộ ủ W ể S, T F-α I -6 ứ ộ ồ ộ ủ ị ế ữ ế ằ W ó ụ ứ ế ế ệ ủ ế (W et al., 2010).12 * ứ ụ ủ Cordyceps militaris: ặ ù Cordyceps sinensis ợ ụ ộ Cordyceps militaris, ứ ụ ủ ũ ự ế ừ Cordyceps militaris ó ể ợ ụ ợ ứ ổ , ó , ó ặ ( , 1999; , 2010) 1.1.4. Nghi n ứu nuôi trồng nấm C. militaris tr n thế giới và Việt Nam 1.1.4.1. 1g r Fứu uô rồ g &. ar rr g ớ ữ ế í ầ ợ ủ ù ự ọ ủ ù ừ ó ầ ở ọ ứ ứ ụ ủ ù ừ ồ ũ ợ ẩ ể ẩ ọ ó ằ ợ ẩ ó ợ T ể ủ Cordyceps militaris ù ự ẩ , ù ó ầ , , ... ở ớ Nam Á Hongkong, Loan, Trung (Che et al., 2003) T ể ũ ợ ụ ồ ổ ứ ớ , ộ , ợ , , , ớ (Wang et al., 2006) ừ ù ứ , ổ , ó , ề ủ, ế ( , 2010) ệ ó 30 ẩ ó ứ ừ C. militaris (Huang et al., 2010). T ớ ự ế ề vai , ồ cung v ữ ợ ự , ù ớ ự ế ộ ủ khoa ọ ệ, khoa ọ ế ớ ó ề ứ ồ Cordyceps í ầ ằ ủ ộ ồ cung, ủ ù ù th o hiện n ó 3 : ự , y bằng ( ệ sợ ) y t o thể qu ù ặ ch t. ù Ophiocordyceps sinensis ( ọ Cordyceps sinensis) ế ự ề ệ , ệ ợ ồ ( ể ) , ó ợ ợ ứ ủ ầ ủ ị ( 2006; Stone 2008; Zhang et al. 2012). ộ ù ổ ế ớ O.sinensis Cordyceps militaris ( : F ) , ó ế ớ ở ộ ừ 0 - 2 000 ự13 ớ ể ( , 1941; , 1958; , 1995; S , 2005; , 2007) ợ ọ ớ , ó ể ễ ằ ó ề ồ C. militaris ợ ộ ồ ế O. sinensis ó ứ ợ ó ọ ợ í ự O. sinensis í ó , ứ ế ế ( , 2006 , ; , 2006; Yu et al., 2006; Ni et al., 2007; Gao et al., 2008; Yue et al., 2008; Zhou et al., 2009; Das , 2010; , 2010; , 2010; Z , 2011; , 2012) T , ầ ó ứ ợ ằ ị ợ ế ể ị í ị ỡ ủ ( , 2008) ớ O. sinensis ồ ợ ỉ ể ể , C. militaris ó , ó ợ ụ ể ứ ộ (S , 2004; , 2008; Z , 2009; X , 2010) ở ề ệ ị ặ O. sinensis, C. militaris ó ộ ế ớ T , ộ ự ủ ể, ợ ể ự , ó ữ ầ ó ề ứ ệ ớ ể ứ ụ ợ ọ ( , 2007; , 2007) ầ , ộ ỉnh của C. militaris ũ ợc gi ự ở ề ứ ề lo (Z , 2011) ó 400 ợ , ỉ ó 36 ợ trồ ều kiệ ể s n xu t thể qu (Wang, 1995; Sung, 1996; Li et al, 2006). Trong s nhữ , ỉ ó C. militaris ợc trồng ở q ớn do ó ó ợ í t t ó i gian s n xu t ng n (Li et al, 2006). Hiệ , ó nhiề ứ ề ồ m C. militaris ằ ế O. sinensis ó ề ứu quan trọ ề , ầu din ỡ , , ặ í ó ợ ủ C. militaris. Từ ế ỷ 19, ọ ứ ể ù (Shanor, 1936; , 1970) ó ứ ồ ợ ữ í ệ14 ( , 1941; , 1968; Y , 1982) ồ C.militaris ứ ị ế ù ợ ủ ứ ó ó ớ ệ ể ỡ ớ ủ ộng trong việ y t o thể qu , ứu thu nh n hệ sợi trong n í ần của hệ sợ , ọc th y rằng ợ ần của một s ch ặ ó í ủ ù th o, , ợ ự T ớc v ề ó, ó ng ợ ứu sao cho tỉ lệ ầ , é , ergoster … ủa hệ sợ t gần gi ng vớ ầ ự T , y thu hệ sợi vừ ộ , ừ ệ hiệ i ( í nghiệ ụng, hệ th ù t khe, hệ th ự ộng ó , ệ th ng thu hồi s n phẩ …), t tiề ỉ ó ể phổ biến ở , p n xu t (Baral et al., 2012). Mộ ở l , T c, Nh t B , Qu ứu nhiề ồng t o thể qu n m Cordyceps ù t r ằm kh c phụ ợ ợ ểm củ y l ng thu hệ sợ ằ ợc s n phẩm gần với tự t. Một s ợ y Cordyceps militaris ộng tằm ở c, Trung Qu T ũ ớc t ứ ổ biến ồng n m Cordyceps militaris ng vớ t nề o. Tuy , ề ầ ợc ch t của thể qu ũ ợi n ợc từ o cầ ợ ứu nhiề ể ứ ầ ề ợ ừ C.militaris, ù ớ ệ ể , ệ ợ C.militaris ũ ộ ớ ứ ể ợ ó ọ ừ ( , 2006; Y , 2006; Gu et al., 2007; Kwon et al., 2009; Xie et al., 2009a, b ; , 2010) ứ ề ợ ó ợ ủ ế ó ũ ợ ữ ầ ( , 2008; Z , 2009; , 2010) * g F a u ô r ờ g u r uô rồ g Cordyceps militaris Cordyceps militaris ợ ồ ể ợ ồ ể ể (2003) ( , 2008)15 ó ề ệ C. militaris. ể ớ ề ợ ể C. militaris ệ ỉ ụ ứ ặ ứ ù ( í ụ, ù ằ B. mori) T , ệ ể ù é , ó ệ ủ ế ợ ó ầ ù ồ , ề ợ T ầ ù ợ ớ ự ể ủ ở ó 4 í ự ể ủ , ồ : ợ , , ồ , ể ( , 2005) ệ ể ặ ẽ ề ệ ộ, ộ ẩ (R , 2009) V ệ ợ ứ ề S ớ , ệ ề ặ ệ ồ , ợ ớ ụ ớ , ồ í ớ ụ ợ T ự C. militaris s ở ế ù ồ ề ệ ó ể ể ề ệ ộ í ệ ể ể , ủ ế ể ứ ề ợ ó ọ (S , 2006; Z , 2008) T ể ợ ồ ứ ( , 1999; S , 2002) ặ ù ù ( , 1995; S et al., 2002) ứ k ũ ệ ở ể có ể ợ adenosin ứ ũ ợ ù ợ ớ ể ( , 2012) * g F a G G g ro g ô r ờ g uô N ó ể ộ , ủ ế ụ ộ ằ Bombyx mori ( , 2010) ứ ũ ó ụ ù ể ù ớ Antherea pernyi (Wang et al., 2002), Mamestra brassicae (Harada et al., 1995)... N á V ệ ụ ù ở ớ ề ế ề ặ ệ ẵ ó, ự ễ , ó ợ16 ữ ợ ụ ể ế ù X ệ ổ ứ , ợ ể ế ù (X , 2009 ) T , Y et al. (2004) ũ ỉ ằ ỡ ù ợ ệ . ự 2, 4-D, citric acid tria , - ũ ó ở ế ể (W , 2010) ứ ủ (2004) (2012) ệ ổ +, Mg2+, Ca2+ ở ồ ộ 0 1 / ũ ó ể ể ợ ọ ( , 2004; , 2012) T ể ộ ể , 35-70 ( , 2010) Z (1997) ế ầ 35–45 ể , ụ ( , ) ể ẽ * g F a u ô r ờ g uô F a ệ ộ ó ở ớ ế ệ ể ồ ứ ệ ộ 18 – 22 ự ở ể T , ẽ ệ ộ 25o (S , 1999, 2002; , 2000) ó, ầ ề ế ệ ộ ồ ề ệ ế ồ ở ự ó ệ ộ í ợ , ụ ề a á á ộ ũ ở ớ ế ể T ề ệ , ệ ể ứ ế ( , 2000; S et al., 2002) ứ ộ ở ủ ó ể ộ ù ủ , ừ 500-1000 l ợ ề ệ ợ (Sung et al., 1999; Gao et al., 2000; Sato et al., 2002) ầ ế ế ế ộ ế ù ợ ề ệ ớ C. militaris. a á m ộ í ự ở ủ ổ ứ ệ ụ F ( ) ế ề ệ ể C. militaris (Zhang et al., 2010).17 ẩ ộ ợ ộ ừ 70–90 %, ớ ộ ẩ í ự ẽ ù ợ ệ ể ộ ẩ ẽ ế ự ể ủ ũ ể ó, ầ ổ ẩ ằ ẩ ớ ồ ớ ẩ ộ í ẩ ộ, ị C. militaris ầ ợ pH tro 6 0 – 6 5, ệ ộ 20 – 25 ổ ồ ỡ , (S , 2006) * 9 o a g g ro g uô F &. ar T ó ề ọ ệ ồ C. militaris ề ệ Sự ó ể ệ ở ệ ộ ở , ộ , ể , ũ ổ ề ớ ể , ự ó ể ệ ở ệ ợ ợ ó ợ ể T ó ể ó ế ệ ù ế ợ ừ ặ , ệ ó ẽ ở ầ ứ ặ (S , 2004) T , C. militaris ó ợ ừ (S , 2004; S , 2006) V ệ ũ ợ ồ ầ (S , 2006) í ủ ứ ủ 2010 ộ ứ ệ ữ ở 4-100 ó ể duy tr ể ế 6 (S , 2006; , 2009) ứ ũ ỉ ằ ó ự ệ ữ ế ổ ở ứ ộ ự ó ủ C. militaris ( , 2003), í ế ợ ị ể ệ C. militaris ầ ứ ầ ề , ể ợ ể et al (2010) ể ị ợ (24 98 / ể ) khi Che et al (2004) ủ ó ổ ị ộ ế ằ UV ( , 2004; , 2010). N ợ 0 5- 1 ộ ẩ S ụ ự ặ ủ í ợ ệ ể ể , ồ ó ể ụ18 1.1.4.2. 7 g r Fứu &orG FH ar 9 1a Mặ ù ù th ó t quan trọng trong y họ ực phẩ , ó ị lớ ứ n xu ù th o ở Việt ầm l ng. S ợ ứu về ù th m ó í : ứu về ần n m Cordyceps của viện Khoa họ ệ , ứ ầ c Việ ó c tới Cordyceps ( ỗ T , 2012) cộng sự kết hợp vớ T ù Th o t i Việ ể ể ù th o Daibio. Nguyễn M u Tu , T ứu Thực nghiệ ệp ồ , ệ 2 c ù th o ở 2 s n phẩ nhộ ù o (Cordyceps militaris) ộng tằ ù th o tằm (Cordyceps takaomontana hay Paecilomyces tenuipes) ằ dễ ụ ữ ều kiện k thu t nh ị ; ù ợ ới ợc V Y ế ồng s n xu t th nghiệm hai lo ộ é T ù Th o. Nhữ ứ ầu t ở ớc ề ề, ở quan trọng cho việ ề xu ể ề ứ ồng th nghiệm ù th o Cordyceps militaris t i 3 tỉ S , ệ , ết qu ứu củ ề ẽ ó ần quan trọ ệ ợng ợc s n xu ớc với ch ợng cao, t ều kiệ ển kinh tế ị , ự ứu khoa học. 1.2. ặ điểm tự nhi n, kinh tế, xã hội ủa iện Bi n, Lai Châu, Sơn La 1.2.1. Tỉ Đ % r 1.2.1.1. Đ u ki n tự r , , xm ội ỉ Đ % r ệ ộ ỉ ề ằ ở í T , ó ộ ị ừ 102 00 10' ế 103 00 36' ộ ừ 20 00 54' ế 22 00 33' ĩ ộ í ớ ỉ , í ớ ỉ S , í T T ớ ớ ộ ủ ớ ỉ V - T . ệ ó í ộ ệ ớ ó ù , ù í , ù ó , ề ớ ặ í ễ ế , , í ị ở ủ , ị ở ừ ủ ó ó .19 ệ ộ ừ 21 – 230 , ệ ộ 12 ế 2 ( ừ 14 – 180 ), ó ệ ộ ừ 4 – 9 (250 ), ỉ ự ó ộ 500 ợ ừ 1300 ế 2000 , ù , ù é ừ 10 ế 4 ộ ẩ ừ 76 – 84%. 2 Tở T T ộ ệ T ầ ( ự è ) ó ệ ộ 24,40C, ộng từ 10,4 – 35,80 ; ộ ẩ t kho ng 80%, ù ợ ớ ể ủ C. militaris. 1.1.2.2. ĐặF ểm v u ki n tự r , - xm ộ xm 7ỏa 7 , uy n Tu * o * Vị í ịa ý, ặ m t T T ộ ọ ểm thuộc huyện Tuầ – tỉ ệ ới tổng diệ í 5 703,5 2, ợ 7 n vớ 3 ầ ộ ù s ’ , T T ó ộ ’ ế 80%, 20% T X T T ó ị í ị : - í T T ớ T n – huyện Thu - í T ớ - í ớ T - í ớ S ị T T ểm trở ng, chủ yế ồ , ù nhiề ù , ặc biệ è S ở T T ớng T c – , ồ ếm kho ng 70% diệ í , ó ộ cao từ 800m trở , ó ộ cao từ 500 – 600 , ộ d c trung 12 – 200 ó ũ p nằm r ở n. í T T ộc khu vực nhiệ ớ ó ù , ù è ịu sự nh ởng củ ó ó í u T T ợ 2 ù , ó ù ( ừ 5 ế 9), ù ( ừ 10 – 4) ệ ộ 18,2o , ộ ẩ 87%, ợ 1 805 / B í ã T a T (Tuầ G á , Đ )20 T T T ủ yế ừng, nổi b ỗ Nghiến, , T ủ yế ền phiến th , ộ ó , ỡ r í ợp cho việc trồ ực, thực phẩ , ệp ng X T T ó ồi c í ợ ó ng Qu c lộ 6 ( ớ ng s 41) ch ng Qu c lộ 279 ( ớ ng 42) ch t thu n lợi cho việ , ớ , ệ n. * T nh t , ă óa – ã i X T T ó ột vị í i thu n lợi cho việ ển kinh tế - ội, ó t r í ợp cho trồ ực, thực phẩ : , , ỗ, l c... ệp ng : ; nghiệ : è, , è T ủ U T T ển t ù , ể phục vụ nhu cầ ù , ự cung tự c í T ữ ầ , ều kiệ ể è ới ở mứ ộ n chế. Cụ thể, tổng diệ í nghiệp củ 1 241,5 , ó ệ í n xu , ếm 450 ế 430 , Tổng s ợ t 502,5 t n, s ợ t 2,088 t n. Một s ồ : , Ý ĩ l ệu qu kinh tế , ợc hết s diện í ự kiến. Thế m ủ T T ển kinh tế gia cầ X ó , ầ ể ổ ịnh, dịch bệnh x ể V ù i tiế í ều ở ến việ T , , ự ới tổ 1 382 T ó T , ếm nhiều nh : T 794 , ếm 57,5&, 487 ế 35,2%, , ựa. 1.2.2. Tỉnh Lai Châu 1.2.2.1. Đ u ự r , , xm ộ ỉ /a & âu ỉ ớ ộ í T ủ V ệ , T ủ ộ 450 km ề í , ó ọ ộ ị : Từ 21o51’ ế 22o49’ ĩ ộ , ừ 102o19’ ế 103o59’ ộ í T ỉ V ủ T (265,095 ớ ), í T ỉ ệ , í21 í ế ớ ỉ Y , í ế ớ ỉ S . ằ ù , í ể ủ ù T , ó , í ịu ởng củ ệ ộ trung b ng 210C- 230 ợ 2 ù õ ệ ( ù , ừ 5 ế 9 ù , ừ 11 ế 3 ) ợ ừ 2.500 – 2 700 / ều, t p trung chủ yế ù è ( ừ 6 ế 8) ng chiếm tới 70 – 80% ợ ; ừ 12 ế 3 ợng í , ỉ chiểm kho 20% ợ ộ ẩ t kho ng 80%. ệ S ồ nằ ị í , ó ọ ộ ị : 21o58’ - 22o10’ ĩ ộ , 103o02’ - 103o36’ ộ ế ộ í ệ ớ ể , ệ ộ ớ ự ỉ í ù õ ệ ù é ừ 5 ế 9, ệ ộ ộ ẩm cao, n ệ ộ ù ộ ở ứ 250C - 350C. Mù ầ ừ 11 ế 3 , í , ộ ẩ ợ , ệ ộ ớ 200 , ặ ệ ữ ự , ệ ộ ệ ữ ớ ộ ẩ 80%. Huyệ T ng nằm ở í c của tỉ , í huyện Phong Thổ, í T ệ S ồ ị , í huyện Sa Pa (tỉ ), í ệ S ồ ệ T U huyệ ó ị ức t ợc c u t o bởi nhữ ớng T c - í S é 80 ới ỉ 3 143 , í S é ng 60 km, xen kẽ nhữ ũ i... í í ch ó ù í ế , ó , í 2 ù õ rệ : ù ừ 5 ế 9, ó ệ ộ ộ ẩ ; ù ầu từ 11 ế 3 , í u l , ộ ẩ ợ p, nhiệ ộ 21º -23º ợ ừ 2.500-2.700 mm, ề , ớng ó ủ yế ó T ó , í ịu nh ởng củ ó ù c. ệ S ồ S ộc huyệ T ứ ợ ều kiện cần thiế ồ ù th o C. militaris ằ22 1.2.2.2. ĐặF ểm v u ki n tự r , - xm ộ xm 6ơ % , u n Tam Đ ờng, tỉ /a & âu * Vị í ịa ý, ặ m t Vị í ịa ý S õ í ộ ệ T , ó ổ ệ í ự 10 829,14 Vớ 3 279 ẩ 9 ộ ù : , T , , , , , , ộ 30 / 2 ó ị ớ í : + í , ệ S , ỉ + í , T , ệ T , ỉ + í S X ồ, ệ S , ỉ + í T , ệ T , ỉ T ị ó ộ 4 32 , ề ệ ợ ệ ể ế ộ Địa ị ị ớ , ủ ế ũ ồ ự ồ ợ ổ ề ó ộ ừ 1 100 ớ 2 900 ù ó ề ể ừ Đ ề X S ằ ự í ệ ớ ó ù ệ ớ - ệ ộ ừ 24 – 260 , ệ ộ 350 ệ ộ 6 - 80C. - ợ ớ , 2 600 / , 3 600 / , 1 800 / ợ ề , ủ ế 5, 6, 7 8 - ộ ẩ í 85%, ộ ẩ 58% S 1 900 / - S ũ ộ ù í ù ù B í ã S (Tam Đ ng, La )23 T - T : X S ó ổ ệ í ự 10 829,14 ế 15,81% ệ í ủ ệ T T ị ó ề , ó ủ ế ù ồ ụ, ế ổ ủ ế ở ự ồ ớ , , ù … , í ở ợ ệ ể ệ ệ T ớ : T ị ó 2 í ó ổ , ề , ồ ớ ồ ù ợ ệ ể – ệ ớ , ó ẩ T ừ : T ệ ệ í ừ 2011, S ó ổ ệ í ệ 7 090,99 ế 65,4% ệ í ự T ó, ừ 210,76 ế 1,95 %, ừ ộ 6 880,23 ế 63,53 % Tỷ ệ ủ ù 49 % ù ệ ủ S , ó ệ í ừ ó ữ ợ ỗ ỗ ớ * T , ă óa – ã i ệ ó 3 279 ẩ ớ 645 ộ ó 9 ộ ( ó ộ ế 60,9%, ế 12,6%, ế 9,6%, ế 7,8%, ộ ) 4 - 5 ẩ / ộ Tổ ộ 2 041 ế 65,42 % ổ , ó ệ ĩ ự , ệ 1 907 , ế 93,43% ổ ộ 1.2.3. Tỉnh Sơn La 1.2.3.1. Đ u ki n tự r tỉ Sơ La S ỉnh miề ộ ù í T c Việt Nam, nằm ở khu vực ủ ù , ó ọ ộ ị ừ 20039’ ến 22002’ ĩ ộ B ừ 103011’ ến 105002’ ộ , ó : í ỉnh ỉ Y ; í ỉ T , ớc Cộ ủ ; í ỉ ỉ T ọ; í T ỉ ệ S ằ ù í u nhiệ ớ ó ù ù , ù , ù è ó g ẩ , ều. í S 4 ù õ ệ : , , , S ó ẩ ù ó ù ữ ù ù . Se se l ù nh bu ù Nhữ ầ ệ ộ í24 / ó ớ 20 ớ ừ 0,50C - 0,60 ( S La từ 20,90 21,10 , Y ừ 22,60 230 ); ợ ó ớng gi ( từ 1.445mm xu ng 1.402mm, Mộ ừ 1.730mm xu ng 1 563 ); ộ ẩ í ũ m. Khu b o tồ ( ộ , huyện Thu ) ó ộ cao từ 1000 ế 1800 ới mự ớc biể ịu ởng củ ó ù B ệ ộ i th p (190C). Về ù t hiệ ợ 1 500-1 600 / , p trung từ 5 ế 8, ộ ẩ 85% ự ó ều kiện tự í ợp nh nghiệ ồng n m C. militaris ằ t i tỉ S 1.2.3.2. ĐặF ểm v u ki n tự r , - xm ộ xm 0 ờ g e, u n Thuận & âu, ỉ 6ơ /a * Vị í ịa ý, ặ m t X É ộ ù II ủa huyện Thu , ị í ằ huyệ 25 , ó ổng diệ í 8 925,3 , ị ủ yế ồ X É ó ị í ị : - í ới huyện Tuầ , ỉ ệ ; - í ớ ổ ; - í T ớ É T ; - í ớ ổng L p. X ó 31 , ó ó 27 ộ , 2 ộ , 2 tộ ó ng Qu c lộ 6 , t, thu n tiện cho việc ển kinh tế - ộ ị Về : ệ í t tự ủ 8.925,3 , ó t ệp 2.862,1 , ồng thủy s n 34,4 , t trồ ệp 15 ha, diệ í ừng 3.345,7 , ộ che phủ của rừ t 37,5 %. * T , ă óa – ã i - Về : Tổ ứ ( , , ) 7.140 con, tổn ầm kho ng 38.000 con. Thu nh ầ 3 650 000 / / i B í ã M É (Thuận C , S La)25 s ng v t ch t tinh thần củ ợ i thiện. S hộ ó ức s ở ếm 50% tổng s hộ. - Về è : Tổng s hộ n è 2006 474 ộ chiếm 42% tổng s hộ è ; 2007 ó 555 ộ chiế 40%, 2008 ó 556 ộ chiếm 41,5%; 2009 ó 575 ếm 41,5%. X É ộ ó ị ộ , ở , ở h tầng kinh tế ển nh ều kiện phục vụ kinh tế - ộ : ệ , , thủy lợ , ớc sinh ho , ng học gặp nhiề ó T liệ 2009 ổng s ở t 38 ộ, chiếm 2,93% tổng s hộ S hộ ợc s dụ ện ới qu 283 hộ chiếm 20,8%; s hộ ợc s dụ ớc sinh ho t hợp vệ sinh chiế 90% ó 11/31 ợ ầ ó ểu m , , ữ ù ặp nhiề ó - Về ĩ ực kinh tế: Kinh tế củ ủ yế ệp, dịch vụ ển , lẻ i s ụ thuộc chủ yế ộng s n xu t ệ , ộ , ịch bệnh, diễn biến phức t ộng trực tiế ến kết qu s n xu t của ng ị thu nh p th p, theo s liệu th 2009, ổng s ợ ự 2009, ổng s ợng ự 2009 t 221,83 t , 373 / / - Về ĩ ự ội : S ng học thuộ p b ị ồ ó 1 T T, 1 ng THCS, 02 ng tiểu họ , 01 ng mầ X ó 01 m y tế vớ 04 ng bệ t chuẩn qu c gia. S hộ ị , 2006 ó 1 124 ộ, ế 2009 ó 1 293 ộ 169 ộ chiếm 15,03% (Gồm hộ mớ ự ộ ở chung theo t ớ ) 1.2.3.3. ĐặF ểm v u ki n tự r , - xm ộ xm &o 0ạ, huy n Thuận & âu, ỉ 6ơ /a * Đặ m về ều ki n t Vị í ịa ý X ột ủ 6 ù ủa huyện Thu , ằm ở í T c của huyệ , ện Thu ng 45 km. Co M thuộ ù , ù , ặc biệ ó , ộ 134, 135 ủ í26 phủ với tổng diệ í ng 14.657,7 X ó ị í ị í ừ 210 17’30’’ ến 210 21’30’’ ĩ ộ B 1030 32’00’’ ế 1030 40’00’’ R ới củ : - í : ớ - í : ớ ề - í T : ớ - í : ới T Địa ịa th X ó ị t phức t p, bị chia c t bởi nhiề , ều khe c lớn, phần lớ ị ( ó ộ cao so với mự ớc biể 1000 ), diệ í t bằng chiếm tỷ lệ r t nh . K í ậu X mộ ó 2 ù õ ệ : ù ừ 5 ế 9, ù từ 10 ế 4 ặc biệ , 2,3,4 ữ ó x ừng nhiều nh t. + ợ 1500 7 ng 8, chiế 65 % ợ + ộ ẩ 85%, 90% 6 - 7. + Nhiệ ộ ừ 22 ến 28oC. + S ù ng xu t hiệ 11 ế 3 + S t hiệ , ó ợ é é 4 - 5 , ng xu t hiệ 12 ế 2 Địa ch a - Về ịa ch : thuộ 2 ó í ến ch t với : , , ệp th phiến th é , ch. - Về : ó 2 í : + ù : từ ộ cao 1.500 m – 2.000 m so với mặ ớc biển, lo ếm tỷ lệ nh . + F ù ể ặ ến ch ng từ ộ 1 000 ến 1.500m so với B í ã M (Thuậ , S La)27 mặ ớc biển, t p trung phần lớn ở ộ í ủ í t tầ ó ộ ừ 50 ến 1 , ộ d c mặ 35% Th ă Hệ th í , ng c n kiệt về ù , í ó 2 i í i N T i N m Nhừ, i nh ng chỉ ó ều ớ ù , ng h , ế ớc sinh ho ớc s n xu t ệp về ù t lớn. T Diệ í t tự ủ 14 657,7 , ó t ệ 2 525 , ồng thủy s 21,89 , t trồ ệp 12 ha, diệ í ừng 8.098,8 , ộ che phủ của rừ t 55,3%. * Đặ m về kinh t - ã i D c: T ị ó 3 ộc sinh s : ’ , T , T ó, ộ ’ ếm kho 80%, T ếm kho 15%, D a : - ộng: Tổ ị 5 605 i, sinh s ng trong 22 b n, vớ 2 803 ộng. M ộ 25 i/km2. Tỷ lệ s 3,2% - ị ồ ều, t p trung nh t chủ yếu ự , S n xu : S n xu ệp chiếm tỷ lệ cao (94,5%), tỷ trọng s n xu ệ nh , du lịch ch ể , ực nền kinh tế b ầu chuyển từ tự cung tự c p sang s n xu ó - Về trồng trọ : ồ í ồm N , , ớ , chủ yếu theo t ền th ng qu , t th ực ầ 250 / - Về : ồn thu nh p quan trọng sau trồng trọt của nhiều hộ Tổ ( , ợ , ) 5 727 , ầ 8.366 con. - Về s n xu ệ : ồng rừng: Mớ ợc thực hiện trong kho ng 10 ầ , ớ ầ t kết qu t , ến nay diệ í ồng mớ ợc 300 ừng.28 , ự ề ệ ự ủ ị ỉ S , ệ , , ế ớ ặ ể ù ợ ớ ở , ể ủ ù , c ị ó ều kiệ í ợ ù h th Co M (Thu , S ), T T (Tuầ , ệ ), S (T , ).29 PHẦN 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật iệu nghi n ứu, hóa hất, thiết ị 2.1.1. 9ậ u Chủng n m: Chủng n m NBRC 100741 Cordyceps militaris ợ c p bở S ọ ộ V ệ ệ Ứ ụ (T Biological Resource Center, National Institute of Technology and Evaluation (NBRC)). Tằm/nhộng tằ (Bombyx mori-Linnaeus) ợc cung c p gi bở T ứ ằ T ; ở ổ phầ tằ ộ (Thị tr ng Mộ , ện Mộ , ỉnh S ); i huyện Thu (S ) Nguy n iệu bổ sung: , ớc dừa, g o lứt. 2.1.2. + a F t bị Hóa hất: cao n m men, pepton; KH2PO4, MgSO4.7H2O, HCl, KOH (Scharlau - T ) cồn 90o; 1 ( ổ phầ ợc V ế H ) Thiết bị: nồi h ù T – SS 325 (Tomy - Nh t B n), nồi h ù SA300VF (Sturdy - ); ồng c ù ( - M ); ể (Schott - ức); nhiệt ẩm kế (HTC - Trung Qu ); c ổn nhiệt SI-300 (JeioTech - c); nồ ự ộng (YUIN – c); bộ h n gi t t mở thiết bị ện (Panasonic - T ); ủ l -500C (Panasonic - Nh t B n) tủ s y (Heraeus - ức); ề ( – T ); Y 118 (T – ); ớ (V ệ ) í ẩn l c. 2.2. Phƣơng pháp nghi n ứu 2.2.1. 3 ơ g u ra, ảo ọ ệ ớ ớ ề C. militaris ể ( ồ ) í ệm trọ ểm c p N ớc về N m học (Viện Vi sinh v t, Học viện Khoa học Trung Qu c) chuyến t p hu n t i C ệ Sinh học Boshiyuan, Qu n Jinming, Lishui, tỉnh Chiết Giang (Trung Qu c). X ị ự ó ề ệ ự í ợ ồ C. militaris ằ 3 ỉ S , ệ , ự :30 - ệ ề ế , í , ị ợ ở í ợ ự T , - ệ ề ằ ợ ở 5000 ộ ộ 16 , 11 ệ ủ 3 ỉ S , ệ , , gồ ớ : T ế ế ế , ế ề ; ề ỉ ế ; ề ự ằ ề ệ ự ủ S , ệ , ế ề ợ ở U ( ế ề – ụ ụ 1). 2.2.2. 1 ơ g ực nghi m 2.2.2.1. 1g r Fứu ặF ểm c a n m C. militaris 2.2.2.1.1 N ứ ặ m hi n vi c a n m C. militaris ù ù , ần hệ sợi của n m, c y ch ể ĩ Petri có ứ ể ng n ặ ĩ ều kiệ ó , ệ ộ y 25o n ợ ề ề mặ ng th ĩ S ó, ù ỗ th ột kh i th ch ặ ề mặt í ể í ều kiện 250 , ó i gian một tuần. L ặ ểm ghi nh n ợc. 2.2.2.1.2. N ứ ặ m c a n m C. militaris (1) Tá t ADN T ế ổi củ ( dụng phenol) - ớc 1: L y kho ng 300mg hệ sợi n ỗi ng Eppendorf 2.0 ml. - ớc 2: Bổ 250 µ 2X T (2% CTAB, 100 mM Tris-HCl, 1.4 M NaCl, 20 mM EDTA, pH 8.0) cho mỗi m u. S dụ ề ến khi m u ồng nh t. - ớc 3: Bổ 250 µ 2X T ỗi m ộn bằ V - ớc 4: Ủ ở 65o 60 ớ ó T ủ, trộ í t một lần bằ V - ớc 5: Bổ ù ột thể í (500 µ ) - isoamyl alcohol (24 : 1) ỗi m u. Giữ chặt n c m ế ó ũ T ếp tục l ị ể ũ ó - ớ 6: ở 13 000 / 12 ịch nổi sang ng eppendorf mới.31 - ớ 7: T i m u lần thứ 2, s dụ ù ột thể í : (500 µ ) ầ ẽ ó í t bị ũ ó ở 13 000 / 7 T ần dịch nổi sau khi l ( ặp l ớ ừ 3 - 4 lần). - ớ 8: ợ ợc. Bổ sung 2/3 thể í giữ n ộn nh ó ể th y kết tủ ng. M ợ ể l nh qua ở - 20oC. - ớc 9: Thu nh n kết tủ ằ ở 13.000 / 7 i b isopropanol, giữ l i phần kết tủa. Bổ sung 1 ml 70% ỗi o c n th ở 13 000 / 7 , i b phầ ề mặt (lặp l i 2 – 3 lầ ) ể N ở nhiệ ọ ù ổ 50 µ T (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8) ỗi ng. B o qu n ở - 20o ể phục vụ ứu tiếp theo. (2) ứ Tiế n ứng PCR theo Vilgalys et al. (1990): Ph n ứng PCR khuếc i 2 ù ụ ITS-5.8S (mồ ITS4 ITS5) T ầ t cho một ph n ứ R (50µ ) ồ : R 25 µ , ỗi lo i mồ 1 5 µ (10 ), 2O 19 µ 3µ R ợ ặ ệt với 35 chu kỳ: (1) n biế í : 94 15‖ (2) n b t cặ : 48 40‖ (3) é : 72 1’20‖ T é ỗ ỗ 8’ ở 72oC. Sau khi ph n ứng PCR kế , ểm tra s n phẩ R 1% chứa ethidium bromide với 80V trong 30 – 40 (3) í ADN Gi ự ợc thực hiện bở , ỗ ợc chuyển t i về ó ằng phần mề ể ịnh d ng file. T ự ợc từ ồ ợ ợ ó ớ ể ó ợ ự ồng nh t củ n gen, thực hiện trong phần mềm ClustalX (Thompson et al 1997). S ó, ự ồng nh ẽ ợc s dụ ể ế ự ồng sẵ ó ( -NCBI-M ) ự ọ ữ ự ồ ó ệ ề ầ ũ ể ụ í ệ ự ế ó32 í ự gen sẽ ợc thực hiện trong phần mềm PAUP (Swofford, 2004), y í ế ó ặ ị ( ), ế ó ợ í 1000 ầ ặ ết qu í ự gen sẽ é ị ết lu n m i quan hệ giữ ứ , ế ó ợc hiển thị bằng phần mềm Treeview. 2.2.2.2. 1g r Fứu xâ Gự g u r uô rồ g C. militaris u ô ò g í g * T u a F F u t ả g n tạo nguồn gi ng n m C. militaris cung c F o u r uô Đô g rù g ạ thảo u rữ gi ng 7 í ghi m 1.1. T u a ô r ờ g G G ng Fơ ản ặc: C y ch ểm n m C. militaris 7 ng MPDA, PDA, MCM, SDA, CDA, CZYA, SDAY ó ổ sung 15g agar trong ĩ (25 / ĩ ). Mỗ ức ng b í 30 ĩ , ặp l í ệm 3 lầ ặ í ệm ở 250 , ều kiện t i. í , ị c, m ộ hệ sợi, kết c u hệ sợ ( ộ x p) của khuẩn l c ở mỗi lo 15 y. 7 í g m 1.2. T u a ộ pH C y ch ểm n m C. militaris ng t ợ ịnh trong T í ệm 1 với d ứu 3,0 - 4,0 - 5,0 - 6,0 - 7,0 - 8,0 - 9,0 ĩ . Ở mỗi ức pH, b í 30 ĩ , ặp l í ệm 3 lầ ặ í ệm ở 250 , ều kiện t i. í , ị c, m ộ hệ sợi, kết c u hệ sợ ( ộ x p) của khuẩn l c ở mỗi ức sau 15 y. Kết lu n pH t 7 í g m 1.3. T u nhi ộ uô F y C y ch ểm n m C. militaris ng t ợ ị í nghiệm 1, ở pH t í ệm 2 ĩ ở d i nhiệ ộ 7 ± 0,50C, 15 ± 0,5 0C, 20 ± 0,50C, 25 ± 0,50C, 30 ± 0,50C. Ở mỗi ức nhiệ ộ, b í 30 ĩ Petri, lặp l í ệm 3 lần. í , ị c, m ộ hệ sợi, kết c u hệ sợ ( ộ x p) của khuẩn l c ở mỗi ức sau 15 y.33 Kết lu n nhiệ ộ t Qua kết qu í ệ 1 1, 1 2, 1 3 ợ ng n m C. militaris t ợc s dụ ể ữ gi ng n ( ng ặc) hoặc t o nguồn gi ng n ( ng l ng) bổ ể m. B o qu n gi ng n : ng nghiệm chứa gi ng n ần sau 4 – 5 y sẽ ợc b o qu n ở 4oC trong tủ l nh, c y truyề ịnh kỳ 2 – 4 1 ần. ng l : ó ổ ệ ó ứ ó ầu que c ù ù , ần hệ sợi của n ( ữ trong ng nghiệ ) R , é iệ ó , y gi ng n ng l , ần tiế ẩn th n sao cho gi ng n ị í ệ T ế c trong tủ ó ệ ộ ổ ịnh ở 25oC, t ộ l 120 / , i gian l c 120 gi . M ộ hệ sợi cầ 2 105 CFU. Tiế ồng nh ng chứa hệ sợ ồng nh t, t ộ 120 000 / , 5 ớc khi bổ ể m. * T u a F F u t G G ng ả g n s r ng c a h sợi n m C. militaris 7 í g m 1.4. T u a ợ g ờng glucose C y ch ểm n m C. militaris ng 15g agar/L bổ sung nhộng tằm 80 / , cao n m men 8 g/L, pepton 8 g/L, MgSO4.7H2O 0,3 g/L, KH2PO4 1,0 g/L, vitamin B1 0,05 g/L, pH t i ợ ng glucose í nghiệ ợc b í : 0g/L, 5g/L,10g/L, 15g/L, 20g/L, 25g/L, 30g/L, 35g/L, 40g/L, 45g/L, 50g/L lầ ợ í ệu bở ứ í ệ 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 Ở mỗi thức ợ ng, b í 30 ĩ Petri, lặp l í ệm 3 lầ ặ í ệm ở nhiệ ộ ệ sợi t ( í nghiệm 1.3), ều kiện t i. í của khuẩn l c, ị c, m ộ hệ sợi (+: m t ộ , ++: ộ , +++: ộ cao), kết c u hệ sợ ( ộ x p) ở mỗ g thức sau 15 y. Kết lu ợ ng glucose t 7 í g m 1.5. T u a ợng cao n m men T ần củ ng gồ ó 15g agar/L bổ ng glucose ợc t ( í ệm 1.4), nhộng tằ 80 / , pepton 8 g/L, MgSO4.7H2O 0,3 g/L,34 KH2PO4 1,0 g/L, vitamin B1 0,05 g/L, pH t m men. ợng cao n m ợc b í : 0g/L, 5g/L, 10g/L, 15g/L, 20g/L, 25g/L, 30g/L, 35g/L, 40g/L, 45g/L, 50g/ ợ í ệu lầ ợ C0, C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8, C9, C10. Ở mỗi ức ợng cao n m men, b í í 30 ĩ , ặp l í nghiệm 3 lầ ặ í ệm ở nhiệ ộ ệ sợi t ( í ệm 1.3), ều kiện t i. í ủa khuẩn l , ị c, m ộ hệ sợi (+: m t ộ , ++: ộ , +++: ộ cao), kết c u hệ sợ ( ộ x p) ở mỗ thức sau 15 y. Kết lu ợng cao n m men t 7 í g m 1.6. T u a ợng pepton T ần củ ng gồ ó 15g agar/L bổ ng glucose t ( í nghiệm 1.4), cao n m men t ( í ệm 1.5), nhộng tằ 80 / , MgSO4.7H2O 0,3 g/L, KH2PO4 1,0 / , 1 0,05 / P ợc b í theo d ợng : 0g/L, 5g/L, 10g/L, 15g/L, 20g/L, 25g/L, 30g/L, 35g/L, 40g/L, 45g/L, 50g/L, lầ ợ í ệ 0, 1, 2, 3, P4, P5, P6, P7, P8, P9, P10. Ở mỗi ức ợng pepton, b í í 30 ĩ , ặp l í hiệm 3 lầ ặ í ệm ở ở nhiệ ộ ệ sợi t ( í ệm 1.3), ều kiện t i. í ủa khuẩn l , ị c, m ộ hệ sợi (+: m t ộ , ++: ộ , +++: ộ cao), kết c u hệ sợ ( ộ x p) ở mỗ thức sau 15 y. Kết lu n về ợng pepton t 7 í g m 1.7. T u ợng MgSO4.7H2O T ần củ ng gồ ó 15 / , ng, cao n , t ( í ệm 1.4, 1.5, 1.6), nhộng tằ 80 / , KH2PO4 1,0 g/L, vitamin B1 0,05 g/L MgSO4.7H2O. MgSO4.7H2O ợc b í d i ợng : 0,5g/L; 1,0g/L; 1,5g/L; 2,0g/L lầ ợ í ệ 1, 2, 3, 4 Ở mỗi ức b í í 30 ĩ , ặp l í ệm 3 lầ ặ í ệm ở ở nhiệ ộ ệ sợi t ( í ệm 1.3), ều kiện t i. í ủa khuẩn l , ị c, m ộ hệ sợi (+: m t ộ , ++: ộ , +++: ộ cao), kết c u hệ sợ ( ộ x p) ở mỗ thức sau 15 y y.35 Kết lu ợng MgSO4.7H2O t 7 í g m 1.8. T u ợng KH2PO4 T ần củ ng gồ ó 15 / , ng, cao n m men, pepton, MgSO4.7H2O ( í ệm 1.4, 1.5, 1.6, 1.7), nhộng tằ 80 / , B1 0,05 g/L KH2PO4 ợng KH2PO4 b í theo d ợng : 0,5g/L; 1,0g/L; 1,5g/L; 2,0g/L. Ở mỗi ức, b í í 30 ĩ , ặp l í nghiệm 3 lầ ặ í ệm ở nhiệ ộ ệ sợi t ( í ệm 1.3), ều kiện t i. í ủa khuẩn l , ị c, m ộ hệ sợi (+: m t ộ , ++: ộ , +++: ộ cao), kết c u hệ sợ ( ộ x p) ở mỗ thức sau 15 y. Kết lu ợng KH2PO4 t 7 í g m 1.9. T u ợng vitamin B1 T ần củ ng gồ ó 15 / , ng, cao n m men, pepton, MgSO4.7H2O, KH2PO4 ( í ệm 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8), nhộng tằ 80 g/L vitamin B1 ợng vitamin B1 ợc b í theo d i: 0,05g/L; 0,1g/L; 0,15g/L; 0,2g/L. Ở mỗi ức b í í 30 ĩ , ặp l í ệm 3 lần. ặ í ệm ở nhiệ ộ ệ sợi t ( í ệm 1.3), ều kiện t i. í ủa khuẩn l , ị c, m ộ hệ sợi (+: m t ộ , ++: ộ , +++: ộ cao), kết c u hệ sợ ( ộ x p) ở mỗ thức sau 15 y. Kết lu ợ ợng vitamin B1 t 7 í g m 1.10. T u ợng nhộng tằ Gâu T ần củ ng gồ ó 15 / , ng, cao n m men, pepton, MgSO4.7H2O, KH2PO4, vitamin B1 ộng tằ ợng nhộng tằ ợc b í theo d i 0g/L, 50g/L, 100g/L, 150g/L, 200g/L, 250g/L, 300g/L, 350g/L, 400g/L, 450g/L, 500g/L. Ở mỗi ức b í í 30 ĩ etri, lặp l í nghiệm 3 lầ ặ í ệm ở nhiệ ộ ệ sợi t ( í ệm 1.3), ều kiện t i. í ủa khuẩn l , ị c, m ộ hệ sợi (+: m t ộ , ++: ộ , +++: ộ cao), kết c u hệ sợ ( ộ x p) ở mỗ thức sau 15 y.36 Kết lu ợng nhộng tằ * T u F F ru ả g n sự , r ng c a thể quả n m C. militaris rr g ể bột nhộng tằm (nhộ g gạo lứt) T ần g ể ợc s dụng ể y n m C. militaris gồm ợng ng glucose t ( í ệm 1.4), ợng cao n m men t ( í ệm 1.5), ợng pepton t ( í ệm 1.6), ợng MgSO4.7H2O t ( í ệm 1.7), ợng KH2PO4 t ( í ệm 1.8), ợng vitamin B1 t ( í ệm 1.9), ợng nhộng t ( í ệm 1.10), pH t ( í ệm 1.2) g o lứt (25 / ) ự ể ó í ớc 8x12cm, kh trù ở nhiệt ộ 121oC trong 25 ể sau kh ù ợ ể nguội, bổ sung 10 mL huyề ù ợi n m C. militaris ợ ng l ợc t ( ục 4.2.2). ặt n m trong t i ở ều kiện nhiệ ộ t ( í ệm 1.3) ến khi hệ sợi phủ í ể. Chuyể í ệ ều kiện chiế Tiế í ệ ởng củ ếu t nhiệ ộ, ộ ẩ , ến sự ởng của thể qu . Trong mỗ í ệ , ởng của thể qu ới ởng của từng yếu t q ỉ (*): 1) Th thể qu ( ): ể qu xu t hiệ í ừ ó ệ sợi phủ í ề mặ ể ặ ều kiệ í ệm 2) S ợng thể qu / : ếm từng thể qu 3) Kh ợng thể qu / ( ): ừng thể qu ỉnh kh ể, kh ợng í ó ộ í 10-2g 4) í ớc thể qu (chiề í ( )) Chiề : ừ ến ầu thể qu 5) ng thể qu 6) c thể qu 7) ợng adenosin (mg/g) 8) H ợng cordycepin (mg/g) 9) Hiệu su ể qu : (s ể qu / tổng s ứu) × 10037 7 í g m 1.11. 1g r Fứu ả ng c a nhi ộ tới khả ă g , r ng c a thể quả c a n m C. militaris rr g ể bột nhộng tằm B í í ệm ở d i nhiệ ộ 7oC, 15oC, 20oC, 25oC, 30oC. Ở mỗi nhiệ ộ, b í 30 , ặp l í ệm 3 lầ ặt í ệm ở ộ ẩm 80%, ộ 500 lx, th i gian chiế ục 12/24 gi . chỉ (*). Kết lu n nhiệ ộ t ởng của thể qu . 7 í g m 1.12. 1g r Fứu ả ng c a ộ ẩm tới tới khả ă g ể quả c a n m C. militaris rr g ể bột nhộng tằm ộ ẩ í: B í í ệm ở d ộ ẩm 50%, 60%, 70%, 80%, 90%. Ở mỗ ộ ẩm, b í 30 , ặp l í ệm 3 lầ ặ í ệm ở nhiệt t , ộ 500 lx, th i gian chiế 12/24 gi . ỉ (*) ộ ẩ ể y: T ộ ẩ ể bằ h bổ thể í ề ù ợi n ù ột kh ợng g o: 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 / (25 ù i g o lứt). Kết lu ộ ẩm t ể , ể qu , tổng hợ t ch t. 7 í g m 1.13. Ng r Fứu ả ng c a g ới khả ă g ể quả c a n m C. militaris rr g ể bột nhộng tằm B í í ệm ở ( è è ) ộ 100 , 200 , 300 , 400 , 500 , 600 lx, 700 lx, 800 lx, 900 lx, 1000 lx. Ở mỗi lo ộ , í 30 , ặp l í nghiệm 3 lầ ặ í ệm nhiệ ộ t , ộ ẩm t , th i gian chiế 12/24 gi . ỉ (*) Kết lu n lo ộ cho n ể , ể qu , tổng hợ t ch t. * T u F F u t ả g n sự r ng c a thể quả n m C. militaris rr g ể tự r ( ằm/nhộng tằ Gâu) 7 í g m 1.14. 1g r Fứu ơ g â ễm n m C. militaris t u o ằm/nhộng tằ Gâu S dụng tằm tuổi 5; nhộng tằm tuổi 7, 8, 9, 10,11 CT1. /â ễm n m C. militaris o ằm/nhộng tằm bằ g ơ g gâ CT 1-1 ằm s ù ề ù ợi n m tr 2038 CT 1-2 ộng tằm s ù ề ù ợi n 20 CT 1-3 ằm s ù ề ù ợi n 20 . CT 1-4 ộng tằm s ù ề ù ợi n 20 . ặt tằm/nhộ ụ ù Mỗ ặt 6 con. Tằm/nhộng tằm ức CT 1-3 T 1-4 ợc kh ù ở nhiệ ộ 121o , 15 , ể nguội ở nhiệ ộ ớ ễ , nhiễm tằm/nhộng tằ ù ợc tiế ủ c ọc. Ở mỗ ức b í 30 , lặp l í ệm 3 lầ ặ í ệm ở nhiệt ộ ệ sợi t ( í ệm 1.3), trong t ến khi xu t hiện hệ sợi phủ í bề mặt m u. Chuyển m ều kiện chiế ộ 500 lx, th i gian chiế 12/24 gi , ộ ẩm 80%, nhiệ ộ 25oC. T õ ỉ : Vị í ọc thể qu , í ớc thể qu (mm), kh ợng thể qu (g), s ợng thể qu /con ở ứ Kết lu ễm n m t , ồng th ũ ết lu ợ thể ởng của n m C. militaris. CT 2. /â ễm n m C. militaris o ằm/nhộng tằm bằ g ơ g r CT 2- 1: T 0,1 ề ù ợi n m C. militaris ới da tằm s ng kh ù , ầu 3 mm. CT 2-2: T 0,1 ề ù ợi n m C. militaris ới da nhộng s ng ù , ầu 3 mm. CT 2-3: T 0,1 ề ù ợi n m C. militaris ới da tằ ù , ầu 3 mm. CT 2-4: T 0,1 ề ù ợi n m C. militaris ới da nhộng tằ ù ớ , ầu 3 mm. ặt tằm/nhộ ụ ù Mỗ ặt 5 con. Tằm/nhộng tằ ức CT 2-3 T 2-4 ợc kh ù ở ở nhiệ ộ 121o , 15 , ể nguội ở nhiệ ộ ớ ễ , nhiễm tằm/nhộng tằ ù ợc tiế ủ c ọc. Ở mỗ ức b í 30 , lặp l í ệm 3 lầ ặ í ệm ở nhiệt ộ ệ sợi t ( í ệm 1.3), trong t ến khi xu t hiện hệ sợi phủ í bề mặt m u. Chuyển m ều kiện chiế ộ 500 lx, th i gian chiế 12/24 gi , ộ ẩm 80%, nhiệ ộ 25oC.39 T õ ỉ : Vị í ọc thể qu , í ớc thể qu (mm), kh ợng thể qu (g), s ợng thể qu /con ở ứ í ệm. CT 3. /â ễm n &. ar ua ờ g ru a F a tằ Gâu Cho tằm ở ộ tuổi 1, 2, 3, 4, 5 ổi ợc phun huyền ù ợi n T õ ỉ : Sự ể qu , vị í ọc thể qu , í ớc thể qu (mm), kh ợng thể qu (g), s ợng thể qu /con ở ức í ệm. Kết lu ễm n m t , ồng th ũ ết lu ợc tr ng ễm củ thể (nhộng hay tằm, kh ù ể s ng) t ởng của n m C. militaris. 7 í g m 1.15. 1g r Fứu x F ịnh gi ng tằ ù ợ F o g r Fứu uô rồng n m C. militaris S dụ nhiễm t ể ễm n m C. militaris ể ( ằm/nhộng tằ ) ợc t ( í ệm 1.14) của 2 gi ng tằ é ằ é Mỗ ặt 5 con. Ở mỗi gi ng tằm é é , b í 30 u, lặp l í nghiệm 3 lần. ặ í ệm ở 250C, trong t ến khi xu t hiện hệ sợi phủ í ề mặt m u. Chuyển m ều kiện chiế ộ chiế , th i gian chiếu , ộ ẩm, nhiệ ộ t . T õ ỉ : Vị í ọc thể qu , kí ớc thể qu (mm), kh ợng thể qu (g), s ợng thể qu / , ợ ở ức Kết lu n về gi ng tằ ù ợ ồng n m C. militaris thể tằm/nhộng tằ con. 7 í g m 1.16. 1g r Fứu ả ng c a nhi ộ tới khả ă g ể quả, ợng hoạt ch t c a n m C. militaris rr tằm/nhộng tằm S dụ ễm n m C. militaris t ( í ệm 1.14) thể tằm/nhộng tằm của gi ng tằm t ( í ệm 1.15). Mỗ ặ 5 ặt ều kiện t i, ở nhiệ ộ t ệ sợ ( í ệm 1.3) ến khi xu t hiện hệ sợ ng. Chuyển hệ sợ ều kiệ é , ộ chiế 500 lx, ộ ẩm 80%. B í í ệm ở d i nhiệ ộ 7oC, 15oC, 20oC, 25oC, 30oC. Ở mỗi ức nhiệ ộ, b í 30 , ặp l í ệm 3 lần.40 T õ ỉ : Th ể qu ( ); S ợng thể qu /con; Kh ợng thể qu / ( ); í ớc thể qu ( ); ng thể qu ; c thể qu ; ợ ( / ); ợng cordycepin (mg/g). Kết lu n nhiệ ộ t ể , ể qu , tổng hợ ho t ch t. 7 í g m 1.17. Ng r Fứu ả ng c a ộ ẩm tới khả ă g ể quả, ợng hoạt ch t c a n m C. militaris rr ằm/nhộng tằm S dụ ễm n m C. militaris t ( í ệm 1.14) ể tằm/nhộng tằm của gi ng tằm t ( í ệm 1.15). Mỗ ặt 5 ặ ều kiện t i, ở nhiệ ộ ệ sợi t ( í nghiệ ến khi xu t hiện hệ sợ ng. Chuyển hệ sợ ều kiện chiế bằ è , ộ chiế 500 lx th i gian chiế 12/24 gi , ở nhiệt ộ t ( í ệm 1.17). B í í ệm ở d ộ ẩm 50%, 60%, 70%, 80%, 90%. Ở ức ộ ẩm b í 30 , ặp l í ệm 3 lần. T õ ỉ : T ể qu ( ); S ợng thể qu /con; Kh ợng thể qu / ( ); í ớc thể qu ( ); ng thể qu ; c thể qu ; ợ ( / ); ợng cordycepin (mg/g). Kết lu ộ ẩm t ể , ể qu , tổng hợ ho t ch t. 7 í nghi m 1.18. 1g r Fứu ả ng c a g ới khả ă g ể quả, ợng hoạt ch t c a n m C. militaris rr tằm/nhộng tằm S dụ ễm n m C. militaris t ( í ệ 1 14) ể tằm/nhộng tằm của gi ng tằm t ( í ệm 1.15). Mỗ ặt 5 ặ ều kiện t i, ở nhiệ ộ ệ sợi t ( í nghiệ ến khi xu t hiện hệ sợ ng. Chuyển hệ sợ ều kiện nhiệ ộ t ể qu ( í nghiệ 1 16), ộ ẩm t (1 17) í í ệm với th i gian chiế 12/24 gi ới ởng của lo , ần ộ : CT 1 - Lo : 2 lo ( è è led) ó ộ 700 lx. CT 2 - ộ : 100 lx, 200 lx, 300 lx, 400 lx, 500 lx, 600 lx, 700 lx, 800 lx, 900 lx, 1000 lx.41 CT 3 – T ầ : ợc chiế ằ è ồ 750 ó nh (gồ ó ó với tỉ lệ 1:2) mỗi ó ó 0,05W ới 716 lx. Ở mỗi ức b í 30 , ặp l í ệm 3 lần. T õ ỉ : T ể qu ( ); S ợng thể qu /con; Kh ợng thể qu / ( ); í ớc thể qu ( ); ng thể qu ; c thể qu ; ợ ( / ); ợng cordycepin (mg/g). Kết lu ộ ẩm t ể , ể qu , tổng hợ t ch t. 2.2.2.3. 1g r Fứu xâ Gự g u r uô rồ g C. militaris u ô o ạ u ựF ợF ựa F ợc thực hiệ ng l í ệ ều kiện t ủ í ệ ( ứ ), ợ ể vớ t lớ , ụ thể: i ng trong nồ ự ộ ó í 10 í / ẻ. t t ng: 500 / t c y gi ng: 2000 / ù th ợ ặt t 4 ị ể ó ều kiện tự ù hợp với sinh t ở , ển của C. militaris R 100741 ợc lựa chọn t i 3 tỉ : , É (T , S ), T T (T ầ , ện ), S (T , ) ù th é , í , ó ệ í 30 m2, ợc l p ặ ề ệ ộ 2 chiề , 18 000 TU; ợc l ặt hệ th ng chiếu ự ộng t t, mở (hệ th ó è ợc l ể m u); ợc l ặt hệ th ng phun ẩ ( ) ự ộng (b í ồ ề ần ) &ô g ứF i chứng M ợ ặ ều kiện t ủ í ệm ( ều kiệ ợ p qua kết qu í ệm ở t ó ều kiện ngo i c nh nh ở ế ở , ển của C. militaris ở í ghiệm). &ô g ứF í g m ợc thực hiệ ù th o. ng vớ 10 í / ẻ trong hệ th ự ộng (t T c). S ợng m : 1500 / ợ ồ ặt m u.42 Á ù th : Á ng từ è 25w, ng ộ chiế ( í ệm); Th i gian chiế : 12/24 Nhiệ ộ: ều chỉ ề ệ ộ cho nhiệ ộ t nhiệ ộ t ( í ệm). ộ ẩ : iều chỉ ầ ớ ộ h n th i gian phun ẩm tự ộng ộ ẩ t ộ ẩm t ( í ệm). T o ng ẩ : ặ ù , ổ ớc c trù , ể nguộ ữ , ằ ớ ù ể m b ộ ổ í S dụ , õ ộ nhiệt ẩ ể m b ếu t nhiệ ộ, ộ ẩ ợc ổ ịnh. S p xế ể m u song song với , i diện với hệ th ề ệt ộ. S p xếp m ể sao cho kho ữ ều nhau, m b ợc nh ồ ề , ị che khu t, m b o cho nhiệ ộ th p ợc len l ề ế u, m b ộ ẩ ế ựng m ợ ồ ều. ỉ ầ õ , ịnh: T a , mậ , ị í, m , a + T ệ ợ ( ): í ừ ề ặ ể + ộ ệ ợ : ộ , + Vị í ệ ợ : ớ ể + ( ) + ộ ( ) T a , , , í a q : + T ể ( ): ể ệ í ừ ó ệ ợ ủ í ề ặ ể ặ ề ệ , ệ ộ, ộ ẩ + S ợ ể : ế ừ ể + ợ ể : ừ ể ỉ ể, ợ í ó ộ í 10-2g. + í ớ ể : ề : ừ ế ầ ể í : ầ ế ệ ở ị í ½ ể T ầ ó í q : h ợ43 T m q : ự ự ổ ặ ể ủ ể ( í ớ 7-8 , ớ ầ ể ể ầ ); ự ự ế ộ ợ ở ể ở ủ ể ệ ể 2, 4, 6, 7, 8, 9 ầ T m q m m a: ị ự í ế ứ ể ế ứ ở , ể ủ ù R 100741 í ệ ợ ó ể ế ế í ệ Hình 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm ở quy mô pi ot 2.2.2.4. 1g r Fứu xâ Gự g u r uô rồ g C. militaris u ô ộ g a Lựa chọn hộ gi ù th o s ng ở ó ều kiện tự í ớ ở , ển của C. militaris. - T T dụ ều kiện nhi ộ, g ự r , ộ ẩ â tạo: ớ ( ớ , ệ ộ ho ự ) - T õ , ị ỉ : + Thể qu : s ợng, kh ợng, í ớc. + Thu ho ch + P í ợc - T õ , ị ỉ : + Hệ sợi: Xu t hiện,m ộ, vị í + Thể qu : , ợng, kh ợng, í ớc. + Thu ho ch + í ợc ặt mẫu tại á nhà nuôi tại địa phƣơng ( 700 - 800 lx, nhiệ ộ 20-25o , ộ ẩm 80-90%, th i gian chiế 12 /24 ) - T õ , ị ỉ : + Thể qu : , ợng, kh ợng, í ớc. + Thu ho ch + í ợc T o nguồn gi ng Cordyceps militaris NBRC 100741 (T i PTN) Bổ sung gi ng Cordyceps militaris R 100741 ể g o lứt + nhộng tằm (*) ợc chuẩn bị sẵn (T i PTN) Công thứ thí nghiệm 2 ặt m u trong t i (5-7 ) ở nhiệ ộ 20-25oC ến khi xu t hiện hệ sợi. (Tại PTN) Công thứ thí nghiệm 1 - ặt m u trong t i (5-7 ) ở nhiệ ộ 20-25o ến khi xu t hiện hệ sợi. - 700 - 800 lx, nhiệ ộ 20-25o , ộ ẩm 80-90%, sau 7-10 xu t hiện thể qu . (Tại PTN) Công thứ thí nghiệm 3 ặt m u trong t i (5-7 ) ở nhiệt ộ 20-25oC. ( ƣa đến á nhà nuôi tại địa phƣơng ngay sau khi cấy giống)44 - T T dụng nhi ộ tự r , g ộ ẩ â ạo: + é , ó ệ í 30 2, ó , ó ệ th ng c a sổ mở t ể l y nhiệ ộ từ ng tự + ợc l ặt hệ th ng chiế ự ộng t t, mở (hệ th ó è ợc l ể m ) Á ng từ è 25w, 700 - 800 lx, th i gian chiế 12/24 + S dụng hệ th ó ể t ó ộ ẩm ổ ịnh 80 - 90%. S p xếp m ể sao cho kho ữ ều nhau: + m b ợc nh ồ ề , ị che khu t. + m b o cho nhiệ ộ th ợc len l ề ế u Hình 2.2. Sơ đồ á ƣớc tiến hành và ố trí thí nghiệm nuôi trồng C. militaris quy mô hộ gia đình ƣa đến á gia đình tại địa phƣơng ( 700 - 800 lx, th i gian chiế 12 /24 , ộ ẩm 80-90%, nhiệ ộ tự ) ƣa đến á gia đình tại địa phƣơng ( , ệ ộ tự , ộ ẩm 80-90%) - T õ , ị ỉ : + Thể qu : s ợng, kh ợng, í ớc. + Thu ho ch + í t ợc - T õ , ị ỉ : + Hệ sợi: Xu t hiện,m ộ, vị í + Thể qu : , ợng, kh ợng, í ớc. + Thu ho ch + í ợc - T õ , ị ỉ : + Thể qu : , ợng, kh ợng, í ớc. + Thu ho ch + í ợc Thí nghiệm 3 M u y gi ể Thí nghiệm 2 ặt m u trong t i (5-7 ) ở nhiệ ộ 20-25o ến khi xu t hiện hệ sợi. (Tại PTN) Thí nghiệm 1 - ặt m u trong t i (5-7 ) ở nhiệ ộ 20-25oC ến khi xu t hiện hệ sợi. - 700 - 800 lx, nhiệ ộ 20-25o , ộ ẩm 80-90%, sau 7-10 t hiện thể qu . (Tại PTN) Bổ sung gi ngCordyceps militaris R 100741 ể g o lứt + nhộng tằm (*) ợc chuẩn bị sẵn (T i PTN) T o nguồn gi ng Cordyceps militaris NBRC 100741 (T i PTN)45 T ó, ó ứ í ệm sau: + ứ í ệm TN1-1: T 1 + ế ị ều kiện nhiệ ộ tự , 700 – 800 lx, th i gian chiế 12 /24 , ộ ẩm 80-90%. + ng thứ í ệm TN1-2: T 1 + ế ị ều kiệ , ệ ộ, ộ ẩm tự + ứ í ệm TN2-1: T 2 + ế ị ều kiện nhiệ ộ tự , 700 - 800 lx, th i gian chiế 12 /24 , ộ ẩm 80-90%. + ứ í ệm TN2-2: T 2 + ế ị ều kiệ , ệ ộ, ộ ẩm tự + ứ í ệm TN3-1: T 3 + ế ị ều kiện nhiệ ộ tự n , 700 - 800 lx, th i gian chiế 12 /24 , ộ ẩm 80 - 90%. + ứ í ệm TN3-2: T 3 + ế ị ều kiệ , ệ ộ, ộ ẩm tự - ng vớ 10 í / ẻ trong hệ th ự ộng (t i PTN T c). - S ợng m : 1500 / ợ ồ ặt m u. & F F ỉ ru F g + T , ộ, ị í, , ộ ủ ệ ợ T ệ ợ ( ): í ừ g ề ặ ể ộ ệ ợ : ộ , Vị í ệ ợ : ớ ể ( ) ộ ( ) + T , ợ , ợ , í ớ ủ ể T ể ( ): ể ệ í ừ ó ệ ợ ủ í ề ặ ể ặ ề ệ í ệ ( , ộ ẩ , ệ ộ ự ; , ộ ẩ , ệ ộ ự ) S ợ ể : ế ừ ể ợ ể : ừ ể ỉ ể, ợ í ó ộ í 10-2g.46 í ớ ể : ề : ừ ế ầ ể í : ầ ế ệ ở ị í ½ ể + T ầ ợ ó í ợ ệ ể : ợ denosin + T ể ể : ự ự ổ ặ ể ủ ể ( í ớ 7-8 , ớ ầ ể ể ầ ); ự ự ế ộ ợ ở ể ở ủ ể ệ ể 2, 4, 6, 7, 8, 9 ầ + T ể ồ ù ợ ù : ị ự í ế ứ ể ế . 2.2.2.5. ; F ịnh thờ ểm thu hoạch ảo uả Đô g rù g ạ thảo C. militaris Thu hoạ h: X ị ề ể , ầ ể , ể , ợ 2, 4, 6, 7, 8 9 ầ í ừ k ệ ể Bảo quản: X ị ỉ ợ ( ), í ớ ( ), , ể , ợ ớ ở ệ ộ cao ( V ớ , 1999) ( ), ề ệ ó ặc ó . 2.2.2.6. 3 ơ g â íF a F ro g Đô g rù g ạ ảo Đị ợ g cordycepin aGH o ro g Đô g rù g ạ ảo ằ g ơ g ắF í ỏ g u ă g Fao HPLC (High Performance Liquid Chromatography) T ợ ớ ới một s ổi nh ù ợp vớ ều kiệ í ệm (Mao et al. (2005)). Đị ợng cordycepin M u chuẩ : ( 3394, S , S ) ợ ớc c t ồ ộ ồ 5, 10, 12 5, 25, 50 100 μg /mL ể l ng chuẩn. M ứu (thể qu ) ợ 1 i 85oC ộ ẩm 20%, ó nghiề ộ 1 ộ 20 ớc c 1 i 50o em ly 4000 15 i 4oC. L y dịch nổi, lọ ọc 0,45 μm ợ ù ể ệ th ng HPLC.47 Nồ ộ ợ ị ợng bằng s l ng hiệ Agilent 1260 infinity. Cộ í : ột RP C18 Elips 18 (4 6 250 , í ớc h t 5 μm). Nhiệ ộ cộ ở 25 ộng gồ ớc c ới tỷ lệ 87:13 (v/v). T ộ : 1 / UV-VIS, ớ ó 260 T ể í 10 μ Đị ợng adenosin M u chuẩn adenosin: Adenosin (A9251, S , S ) ợ 90% ồ ộ ồm 10, 20, 40, 60, 80 100 μg/mL ể l ng chuẩn adenosin. M ứu (thể qu ) ợ 1 t i 85oC ộ ẩm 20%, ó nghiền t ộ 1 g bộ trong 10 ml methanol 90% rồ , ặt, l ĩ, ồ 30 , ể , i, bổ sung kh ợ ị m ằng methanol 90%, l ĩ 4000 15 i 4oC. L y dịch nổi, lọc qua m ọc 0,45 μ ợ ù ể ệ th ng HPLC. Nồ ộ adenosin ợ ị ợng bằng s ng hiệ Agilent 1260 infinity. Cộ í : ộ R 18 18 (4,6 250 , í ớc h t 5 μm ). Nhiệ ộ cộ ở 25 . ộng gồ ớc c ( ẩn HPLC) với tỷ lệ 87:13 (v/v). T ộ 1 / UV-VIS, ớ ó 260 T ể í 10 μL. Dựng lầ ợ ng chuẩ ị ữa diệ í ỉnh theo nồng ộ củ . Kh ộ ủ ng chuẩn bằng m u chuẩn cordycepin 20 μ / u chuẩn adenosin 20 μg/ml. 2.2.2.7. 3 ơ g â íF F F F F (Viện Thực phẩm chứ ) í , ằ í é , ằ / S í β- ằ ộ ( – Ireland). í ợ ằ ứ ù ợ í ằ ổ S ( c Absorption Spectrophotometric). 2.3. Thu thập và x í số iệu 2.3.1. 7 u ậ u ệ í ệ ợ é ở ĩ , ủ ó ứ ự ế ự ệ í ệ48 S ệ ề í ợ , ủ ( ệ ộ , ệ ộ , ệ ộ , ổ , ộ ẩ , ộ ặ ể ế ặ ệ , ): í ệ í ợ ủ ự T ( ặ S , ỉ S ), í ợ ủ ự ( ặ T ị S , tỉ ). S liệu ở ộ ợ é qua hệ th ng cộ t ị (phụ lục 2), ặ ù th o. ộ ợc t p hu ể õ , ở , ển củ ù th o. Nh í n xu ợc thiết kế ể õ ở , ển củ ù h th o. Việ õ , é ỉ ở ủ ù ợc thực hiện theo m u (Phụ lục 3). 2.3.2. ;ử í u S liệ ợc x í ần mềm Iristat 4.0. Kết qu ợ ới d ng ± S S ợc s dụ -student.49 PHẦN 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 3.1. ẶC IỂM CỦA NẤM C. militaris NBRC 100741 3.1.1. Kết quả nghi n ứu đặ điểm phân t và hiển vi ủa nấm C. militaris NBRC 100741 3.1.1.1. 1g r Fứu ặF ểm hiển vi c a n m C. militaris Kết qu ứ ặ ể ển vi cho th y cu ặc của tr í ủa n m C. militaris í ó ầu dục ng n, cầ ầ 5 y. Tế d ng thể ( ), ( 3 1 ) t , ộc hoặc ph , ặ ó i mộ ể cu ( ) ợ 5 y. Hình 3.1. Hình ảnh cuống sinh ào t (A) và ào t của nấm C. militaris (B) của C. militaris R 100741 ó ầu dụ ( 3 1 B), vớ í ớ 5 ~ 7 × 2 ~ 2,5μ , í ớ ặ ểm củ í ứ ù ợp vớ ặ ủ C. militaris vớ ứu của Shrestha et al. (2005). 3.1.1.2. . uả g r Fứu ặF ể â ử F a C. militaris NBRC 100741 ứ ặ ể ủ C. militaris R 100741 ợ ự ệ ể ầ ế sau khi , ế ằ ể ộ ầ ủ ế ế ủ ủ ứ ợ ể ệ 3 2. A B50 ặ ù ẩ ứ ề R ợ í ớ ủ ứ ế ( ) ế ứ ế ụ ồ ITS4 ITS5 ợ ể ệ rong ớ Hình 3.2. Kết quả điện di sản phẩm PCR rDNA của C. militaris NBRC 100741 T 3 2, ệ ó í ớ 554 ớ í ớ ủ C. militaris. ự 554 ợ ự ụ ứ ị ị ứ ộ ầ ế ủ ủ ứ ế R ở ộ ầ ẳ ị ợ ự ầ ế ủ ủ ứ ề ể ệ õ ở ự 100741 -1 ACAAGGTCTCCGTTGGTGAACCAGCGGAGGGATCATTAACGAGTTTTCCA 50 100741 -2 ACAAGGTCTCCGTTGGTGAACCAGCGGAGGGATCATTAACGAGTTTTCCA ** * * * * ** ** ** * ** * ** * * * * ** * * * * * ** * ** * * ** * * ** * *** * * ** 100741 -1 ACTCCCAACCCTTTGTGAACATACCTATCGTTGCTTCGGCGGACTCGCCC 100 100741 -2 ACTCCCAACCCTTTGTGAACATACCTATCGTTGCTTCGGCGGACTCGCCC ** * ** * ** **** * ** * * ** * * * * ** ** ** * ** * *** ** * * * * * * ** * *** 100741 -1 AGCGCCTGGACGCGGGCCTGGGCGGCGGCCGTCGGGGGCCCCAAACACTG 150 100741 -2 AGCGCCTGGACGCGGGCCTGGGCGGCGGCCGTCGGGGGCCCCAAACACTG ** * * * * *** *** * * * *** * * * * ** * * ** *** *** * * * * ** ** ** * * * * ** 100741 -1 TATCTACCAGTTTTTCTGAATCCGCCGCAAGGCAAAACAAATGAATCAAA 200 100741 -2 TATCTACCAGTTTTTCTGAATCCGCCGCAAGGCAAAACAAATGAATCAAA * * ** ** * * ** ** *** ** * * * ** * * ** * * * ** * * * * * ** * * ** * * * * * *** 100741 -1 ACTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGA 250 100741 -2 ACTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGA * * ** ** * * ** * * * * * ** * **** * * ** * * * ** * ** ** * ** ** * * * * * * *** M LSU LSU ITS ITS51 100741 -1 AATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTT 300 100741 -2 AATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTT * * ** ** * * ** * * * * * ** ** * ** * * ** * * ** ** ** * ** ** ** * * ** * **** 100741 -1 GAACGCACATTGCGCCCGCCAGCATTCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAGCG 350 100741 -2 GAACGCACATTGCGCCCGCCAGCATTCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAGCG * ** ** * * ** ** * * * *** * * * * * ** **** * * * * * * * ** ** * * *** * * * * ** 100741 -1 TCATTTCAACCCTCGACGTCCCCTGGGGGATGTCGGCGTTGGGGACCGGC 400 100741 -2 TCATTTCAACCCTCGACGTCCCCTGGGGGATGTCGGCGTTGGGGACCGGC * ** ** * * ** ** * * * *** * * * * * ** **** * * * * * * * ** ** * * *** * * * * ** 100741 -1 AGCACACCGCCGCCCCCGAAATGAAGTGGCGGCCCGTCCGCGGCGACCTC 450 100741 -2 AGCACACCGCCGCCCCCGAAATGAAGTGGCGGCCCGTCCGCGGCGACCTC * * ** ** * * ** * ** * * *** * * * * * * * ** * ** * * ** * * * *** * * * * * ** ** * 100741 -1 TGCGTAGTACCCCAACTCGCACCGGGAACCCGACGTGGCCACGCCGTAAA 500 100741 -2 TGCGTAGTACCCCAACTCGCACCGGGAACCCGACGTGGCCACGCCGTAAA * * ** * ** * * *** * ** * * ** * * ** * * * ** ** * ** * * ** * * ** * * * * ** ** 100741 -1 ACGCCCAACTCTGAACGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAA 550 100741 -2 ACGCCCAACTCTGAACGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAA * * * * *** * * ** * ** * * ** ** * * ** * ** * ** * * * * ** * * ** * * * * ** ** * * 100741 -1 CTTA........................................................................................................................... 554 100741 -2 CTTA......................................................................................................................... * ** * Hình 3.3. Kết quả so sánh trình tự nu eotide rDNA 5,8S ribosome ủa NBRC 100741 trƣớ và trong khi nuôi ấy 100741-1 N 100741 N N ậ ; 100741-2: NBRC 100741 q á ứ ; * mứ . ế ự ủ ủ R 100741 ớ ụ ó ộ ù ợ 100%, ứ ủ ứ ợ ữ ứ ộ ầ ủ ủ ẳ ị ủ Cordyceps militaris. ế ợ ự ỗ ợ ự ừ ế ứ í ự Vớ ế , ị ề ĩ ể ứng ợ ự ệ ớ , ể ệ ị í ủ C. militaris ợ ớ Hình 3.4. Vị trí ủa chủng nấm C. militaris NBRC 100741 trong ây phân oại52 , c ế ứ ừ ặ ể , ẩ R ự DN 5,8S ribosom ề ẳ ị ự ầ ế ủ ủ ứ ủ ứ ầ ợ ứ 3.1.2. Kết quả tối ƣu hóa á yếu tố ảnh hƣởng đến tạo nguồn giống nấm C. militaris cung cấp ho quá trình nuôi ông trùng hạ thảo và ƣu trữ giống 3.1.2.1. T u a ô r ờ g G G g Fơ ản ếu t quan trọng nh t quyế ịnh sự ể n ng t ng n ở ển m nh nh t. Tiế y n m C. militaris 7 ng MPDA, PDA, MCM, SDA, CDA, CZYA, SDAY trong th 15 ể ị y t . Kết qu ứ ợc thể hiện ở b 3 1 3 5. Bảng 3.1. Ảnh hƣởng của á môi trƣờng nuôi ấy đến sinh trƣởng, phát triển của nấm C. militaris TT Môi trƣờng Mật độ hệ s á hết cấu s i nấã pắc íố 1 MPDA +++ V t 2 PDA +++ Tr 3 MCM +++ V t 4 SDA +++ V 5 CDA +++ 6 CZYA +++ V t 7 SDAY +++ R m Hình 3.5. Biểu đồ kí h thƣớc khuẩn lạc nấm C. militaris tr n á môi trƣờng 05101520253035404550SDAYCZYACDASDAMCMPDAMPDA ƣờng kính khuẩn ạ (mm)Môi trƣờng53 Kết qu ở b 3 1 3 5 cho th y n m C. militaris ở , ển ừng lo 7 ứ S ự ởng của hệ sợi n , n th y: T ng SDA, n m C. militaris ởng yếu nh S 15 c í ủa khuẩn l 28,5±0,32 ệ sợi n m r , tr ng, tiết s c t T ng SDAY, n m C. militaris ởng yế S 15 y, n í ẩn l 33±0,68 , ệ sợi n x ng, m ộ hệ sợ , ết s c t y. T ng MPDA n ở í ẩn l 35±0,24 ệ sợi r , S 15 y, xu t hiện s c t y do hệ sợi n m tiết ra. T ng CDA, n m mọ ó ệ sợ , , í ẩn l 34±0,13 T ng CZYA, n m C. militaris ển m í ẩn l c n 41±0,51 ệ sợ ồng nh t, tiết s c t t. T ng MCM, n ển ở mứ ệ sợ ng, r t , ề y xu t hiện s c t í ẩn l 34±0,45 T ng PDA, n m C. militaris ởng m nh nh í ẩn l c n 46± 0,15 ết qu ó ể ng PDA ó ủ ầ ỡng ự ở ển của n m trong tự ề mặt th y sợi n , n, mọc chằng chị ặt mặt th ặt sau th y s c t của n ó Kết qu củ í ệm thể hiện ở 3 6. Hình 3.6. Hình thái khuẩn lạc nấm C. militaris (A) và sắc tố do hệ s i nấm C.militaris (B) tiết ra tr n á oại môi trƣờng (Tỉ lệ: 60mm) PDA MPDA CDA SDAY MCM SDA CZYA PDA MPDA CDA SDAY MCM SDA CZYA54 y, n m C. militaris ở é ở ng CDA, MPDA, SDA, SDAY, t ộ sinh tr ở ở ZY , ng t ở ó, ợc chọ ể ữ gi ng n m C. militaris. Trong 7 lo ợc th nghiệ , n th y hệ sợi n , m ộ hệ sợ ết s c t m nh ng SDAY. Kết qu ứu ũ ù ợp với kết qu ứu của Shretha et al. (2006). ng SDAY ợc s dụ ể y l ng thu hệ sợ ồng th ợc bổ o ồng t o thể qu n m C. militaris. 3.1.2.2. K t quả g r Fứu ả ng c a ộ + ô r ờ g uô F y tới sự sinh r ng c a h sợi n m C. militaris y n m C. militaris ng PDA ở một s d i pH: 4,0; 5,0; 6,0; 7,0; 8,0; 9,0 X ị í ủa khuẩn l , ặ ể s c t , ệ sợi n m C. militaris sau 15 y. Kết qu ứ ợc thể hiện ở b 3 2 3 7. Bảng 3.2. Ảnh hƣởng của pH đến sự phát triển của nấm C. militaris TT pH Mật độ hệ s i Kết cấu s i nấm Sắc tố Khả năng phát triển 1 4,0 +++ Yếu 2 5,0 +++ R V t T 3 6,0 +++ R V T 4 7,0 +++ V t M nh 5 8,0 +++ V t T 6 9,0 +++ V m T Hình 3.7. Biểu đồ đƣờng kính khuẩn lạc nấm C. militaris ở dải pH 4-9 0102030405060456789 ƣờng kính khuẩn ạ ( mm)pH55 Kết qu ở b 3 2 3 7, cho th y: Ở pH = 4, n m C. militaris ởng ch m nh t sau 15 ng í ủa khuẩn l 53,7±0,56 ẩn l c n ó , , ết s c t . Ở pH = 5, n ởng m , í ẩn l 70,98±0,48 mm. Hệ sợi n ng, r , ết s c t t. Ở pH= 6, n ởng m , í ẩn l ợc sau 15 70,84±0,72 ệ sợ ng, r , ết s c t Ở pH = 7, n m C. militaris ởng m nh nh t với í ủa khuẩn l 73,36±0,35 ệ sợi n x , ng, tiết s c t nh t. Ở pH = 8, n ởng ở mứ , í ẩn l c ợ 69,58±0,60 ẩn l , ng, tiết s c t t. Ở pH = 9, n ởng ở mứ í ẩn l 58,1±0,19 ệ sợi n , ng, tiết s c t ó m. Sự biểu hiệ ề ặ ểm của hệ sợi n m C. militaris õ ở 3 8. Hình 3.8. Sắc tố do hệ s i nấm C. militaris tiết ra ở á độ pH khá nhau (Tỉ lệ: 40mm) , 7 í ợp cho n ở ển, kết qu ù hợp vớ ứu của Lee et al. (2013) với kết lu n n ển t ng trong kho ng 6 – 7 T , ứu của Jea et al., (2006) th ể nhiều chủng n m C. militaris (EFCC C-5736, EFCC C-5941, EFCC C-5976, EFCC C-6040, EFCC C-6849, EFCC C-7268, EFCC C-7342, EFCC C-7992, EFCC C-8027 F -8549) ó ừ 5,6 – 6. Sự ệ ó ợc do sự nhau về chủng n m. pH=4 pH=5 pH=4 pH=7 pH=8 pH=956 3.1.2.3. K t quả g r Fứu ả ng c a nhi ộ uô F y tới sự r ng c a h sợi n m C. militaris ứu, nh n th y ở ệ ộ , ởng của n m C. militaris ết qu ứ ợc thể hiện ở b 3 3 3 9. Bảng 3.3. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến sinh trƣởng của nấm C. militaris TT Nhiệt độ (0C) Mật độ hệ s i Kết cấu s i nấm Sắc tố Khả năng phát triển 1 7 +++ B Yếu 2 15 +++ B V r t nh t T 3 20 +++ R V M nh 4 25 +++ V M nh 5 30 - ển Hình 3.9. ƣờng kính khuẩn lạc nấm C. militaris ở á nhiệt độ khá nhau Qua kết qu thể hiệ 3 3 3 9, n m C. miltaris ởng t t nh t ở 200 25o S 15 , í ẩn l ủa n m lầ ợt 46,76±0,58 46,34±0,23 . Hệ sợ , ng, tiết s c t ở 20oC, trong khi ở 25oC, bề mặt sợi n , ở mặt sau xu t hiện s c t Ở 7 0C, n ởng yế í ẩn l 26,7±0,12 Hệ sợi của khuẩn l , , ết s c t . Ở 150C, n ởng t , í ẩn l 39,62±0,36 mặ ớc khuẩn l c th y hệ sợ , ặt sau khuẩn l c t t nh t.57 Ở 300C, n m C. militaris ển. Kết qu củ í ệm sự ển của n m C. militaris d i nhiệ ộ nhau thể hiện ở 3.10. Hình 3.10. Kí h thƣớc khuẩn lạ (A) và sắc tố do hệ s i nấm C. militaris tiết ra (B) ở á nhiệt độ khá nhau (Tỉ lệ: 50mm) y, n m C. militaris ởng t t nh t ở nhiệ ộ 20 – 25oC. Kết qu ù ợp với những s liệ ứu của t Ph m Quang Thu (2006, 2009), Ph m Thị T ù (2010), Shrestha et al. (2006), Keawsompong et al. (2009). 3.1.3. Kĩ thuật nhân giống 3.1.3.1. 1 â g g rr ô r ờ g rắ ế ứ ợ ở 3 1 2, ủ ứ ợ ó ( ĩ ặ ệ ), ề ệ ó , ệ ộ 250 S 48 , ầ , ở ẩ 5 ù ù , ầ ệ ợ ủ , ể ĩ ó ứ ể ặ ĩ ề ệ ó , ệ ộ 250C. S 15 , í ớ ẩ 55 – 60 mm. ế ể ể ủ ứ ầ , ở ở ề ệ , ợ ể ệ ụ ụ ứ ế T ế ụ , ù ù , ầ ệ ợ ủ , ể ệ ó ứ ể ặ ệ ề ệ ó , ệ ộ 250C. Sau 5 – 7 , ệ ợ ẩ ủ í ề ặ ệ ( 3 11) 70C 300C 250C 150C 200C 70C 300C 250C 150C 200C58 Hình 3.11. Kĩ thuật ấy nấm C. militaris (A) và á ống nghiệm ảo quản nấm (B) 3.1.3.2. 1 â g g rr ô r ờ g ỏ g ó ể ợ ụ , S Y ặ ớ ừ ù ù , ầ ệ ợ ủ ( ữ ệm) T ế ủ ở 250 , ộ 120 / S 5 – 7 , ệ ợ ở , ó ể ằ ể ừ ụ ó ứ ề ệ ợ ầ ( 3 12) Hình 3.12. Kĩ thuật nhân giống C. militaris trong môi trƣờng ỏng A – m m ; – N ậ ; – H a 5 – 7 3.1.3.3. %ảo uả guồ g g C. militaris NBRC 100741 * %ảo uả g g &. ar rr ô r ờ g rắ ệ ứ ầ 5 - 7 ẽ ợ ở 40 ủ ề ị ỳ 2 - 3 ộ ầ * %ảo uả g g &. ar ro g ô r ờ g ỏ g ứ 5 - 7 , ế ợ ụ ó ể ở 20 - 250 , ề ệ ó S ụ 7 ế A B A B C59 * B o qu n gi ng C. militaris ằ á -800C C ộ ế ứ ệ ợ C. militaris ự , ủ 10% ù ế , parafilm, , ủ , ừ ừ ứ ệ ộ 50C, -250C, -550 ớ ộ -10 / ặ -200C tron 3 , ó ể ủ -800C. 3.2. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUI TRÌNH NUÔI TRỒNG NẤM C. militaris Ở QUI MÔ PHÕNG THÍ NGHIỆM 3.2.1. Kết quả nghi n ứu sinh trƣởng, phát triển của nấm C. militaris tr n giá thể bột nhộng tằm 3.2.1.1. T u F F u t G G ng ả g n sự r ng c a h sợi n m C. militaris rr g ể bột nhộng tằm Nếu hệ sợi n ợ ở ỡng t , ó ở ởng t ủa thể qu . Mụ í ủ ứ ằm t ó ầ ng dinh ỡng bổ thể g o lứt, t o ra s n phẩ ù th o C. militaris ó ợ ủ R 100741 ó ể ợc. 3.2.1.1.2. T m ng glucose Carbohydrat ồ ồ ồ ợ ọ ể C. militaris. T ồ : , , , , ứ ồ ẽ í ợ C. militaris ể ợ ợ (W ,2014) ra, n m C. militaris ó dụ ồn carbon tự ũ ề ứng t C. militaris ó ệ ể phục vụ mụ í ở ển củ Theo Wen et al. (2014), , , ợc th nghiệ ể ều tra ởng của nguồn car ể qu n xu ng chứa amidulin s n xu t s ợng thể qu cao nh t, tiế í ũ ề é ủ , ng ợc s dụ ể n xu ó ệp. ồn cung c í ự ở ển của n m C. militaris ể ứu ởng củ ợ i với sự60 ển khuẩn l c n m C. militaris ế ứ ng chứ ếu t í ệm (yếu t nền) bổ sung nhộng tằ 80 / , m men 8 g/L, pepton 8 g/L, MgSO4.7H2O 0,3 g/L, KH2PO4 1,0 g/L, vitamin B1 0,05 g/L, 15 / ợ í ệ ợc b í : 0g/L, 5g/L,10g/L, 15g/L, 20g/L, 25g/L, 30g/L, 35g/L, 40g/L, 45g/L, 50g/L lầ ợ í ệu bở ứ í ệ 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ặ í ệm ở nhiệ ộ ệ sợi t (20 – 250C), ều kiện t i. m bằng m ng về ặ ể : ệ sợi n m, s c t khuẩn l c tiế y, ta th ĩ ó ệ sợi n m tr ng, ề mặ , í ẩn l c n ết s c t V , ể chọ ợ ợ ng t ự ộ lớn của í ẩn l í ẩn l , é i kết qu chụp nh khuẩn l c của n m C. militaris sau 15 y. Kết qu ứ ợc thể hiện ở 3 13. Hình 3.13. Kí h thƣớc của khuẩn lạc nấm C. militaris ở hàm ƣ ng đƣờng khá nhau Kết qu 3 13 cho th y n m C. militaris ể ở ợ S ự ởng của n m sau 15 , n th y: Ở ứ 0, ổ ng (0g/L), n ở é nh í ẩn l t 72,43±0,22 Ở ứ 1, 2, 3, 4, 6, 7, 8, 9, 10 ởng ở mức í ẩn l c n m C.militaris từ 79,28±0,34 ế 80,56±0,10 mm. Hệ sợi n , ớt, ng , t hiện s c t . Công thứ thí nghiệm 6870727476788082 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 ƣờng kính khuẩn ạ (mm)Lô thí nghiệm61 Ở ứ 5, ó ứa 25 / ng n ởng m nh sau ứ 21 y hệ sợi ng n, m ộ hệ sợ , ồng nh ng í ẩn l 80,75±0,03 Qua kết qu , ợ ng glucose t bổ sung ể m C. militaris 25 g/L. S ới kết qu ợ ng bổ ể y n m của Das (2010) (86,2 / ); T (2014) (15 / ); W (2014) (40 / ) ợ ứ ở mứ Sự ệt , ó ể nhu cầu s dụng nguồn cacbon của chủng n m C.militaris R 100741 ới chủng n ứu. 3.2.1.1.3. T m ng cao n m men ó ọ ự ộ ế ầ í củ Cordyceps ó ụ ồ ữ T , ồ í ợ ự ở ể ữ , , ộ ằ … ợ ồ C. militaris ế ợ ề ẽ ệ ó ể ể ( , 2000, Kobayasi Y.,1941). Theo W (2014), ể y n m C.militaris cần nguồn ổng hợ ó ể bổ sung bằng một trong hai ch n m men, pepton hoặc sự kết hợp của hai ch t. ể ứu ởng củ ợng cao n i với sự ởng của hệ sợi n m C. militaris ế ứ ó ếu t nề (T í ệ 1 5), 25 / , ớ ợng cao n 0 / , 5 / , 10 / , 15 / , 20 / , 25 / , 30 / , 35 / , 40 / , 45 / , 50 / ợ í hiệu lầ ợ C0, C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8, C9, C10 m bằng m t ng về ặ ể c t , ệ sợi n , í ẩn l c n m C. militaris sau 15 y. Kết qu ứ ợc thể hiện ở 3 14 3.15.62 Hình 3.14. Kí h thƣớc của khuẩn lạc nấm C. militaris ở á hàm ƣ ng cao nấm men khá nhau Hình 3.15. Ảnh hƣởng của hàm ƣ ng cao nấm men đến sự sinh trƣởng của hệ s i nấm C. militaris (tỉ lệ: 50mm) 3 14 3 15 ta th y sự sin ởng của hệ sợi n m C.militaris ở i ợng cao n ó ự ể ồ ta th y: Sau 15 y, sự ởng của n c t ó sự ổ õ ệt, cụ thể : Ở ứ 0, y hệ sợi n , , ộ hệ sợ í ủa khuẩn l c nh nh t vớ 66,25±0,07 , ẩn l c n m tiết s c t t. Ở ức C2, n ởng m ớ í ẩn l c 67,62±0,22 ệ sợi n m m , , ết s c t ng y. Ở ức C1, C3, C4 n ó í ẩn l c lớ 2 lầ ợ 73,64±0,13 , 72,79±0,30 , 72,96±0,19 õ ệ sợi n ng, tiết s c t t. ứ í ệm C7 C6 C8 C9 C10 C5 C1 C4 C3 C2 C0 0102030405060708090C0C1C2C3C4C5C6C7C8C9C10 ƣờng kính khuẩn ạ (mm)Lô thí nghiệm63 Ở ức C5, C6, C8, C9, C10 n ó í ẩn l 75,38±0,43 , 80,67±0,16 , 80,08±0,34 , 77,04±0,27 , 76,67±0,41 mm. Hệ sợi n ng, tiết s c t Ở ức C7 (35 g/L), n ởng m nh nh í khuẩn l 83,77±0,36 mm, hệ sợ ng tr ng r , ết s c t m. T T (2014), ợng cao n ợc bổ ng y n 8 / , (2009) 2,5 / í ớ ứ vớ ứu củ (2010) 93,8 / ợng bổ sung nhiề 35 g/L so vớ ứ n tới sự ệ ó ể do nhu cầu s dụng nguồ ủa chủng n m C.militaris R 100741 ới chủng n ứu. Với chủng n m C.militaris NBRC 100741, bổ sung 35g/L cao n m men 3.2.1.1.4. T m ng pepton m men, bổ ồng t o ra nguồn cung c ữ ầ ủ cho sự ển của n , ặc biệ ổng hợp cordycepin (Wen et al., 2014). ể ứu ởng củ ợ i với sự ởng hệ sợi n m C. militaris ế ứu sự ệ sợ ó ếu t nề ( í ghiệm 1.6) vớ ng glucose t 25 / , m men t 35 / , ợ 0 / , 5 / , 10 / , 15 / , 20 / , 25g/L, 30g/L, 35g/L, 40g/L, 45g/L, 50g/L lầ ợ í ệ 0, 1, 2, 3, P4, P5, P6, P7, P8, P9, P10 T õ ởng trong th i gian 15 ể ịnh ợng pepton t . Kết qu ứ ợc thể hiện ở 3 16 3 17 Hình 3.16. Kí h thƣớc của khuẩn lạc nấm C. militaris ở á hàm ƣ ng pepton khá nhau Công thứ thí nghiệm 01020304050607080P0P1P2P3P4P5P6P7P8P9P10 ƣờng kính khuẩn ạ (mm)Lô thí nghiệm64 Hình 3.17. Ảnh hƣởng ủa hàm ƣ ng pepton đến sự sinh trƣởng ủa hệ s i nấm C. militaris (tỉ lệ: 50mm) 3 16 3 17 ta th y ở ứ í ệ , m sinh ởng với t ộ , ụ thể : Ở ứ 0, 1, 2, y hệ sợi n , , ộ hệ sợ í ủa khuẩn l c nh vớ 56,82±0,52 , 42,50±0,46 , 45,27±0,28 mm khuẩn l c n m tiết s c t t. Ở ức P3, P4, P5, P6, n ở ầ ều với í ẩn l 55,96 mm, 54,75 mm, 58,58 mm, 64,54 mm hệ sợi n , , ết s c t y. Ở ức P7, n ởng m nh nh í ẩn l 67,85 mm, hệ sợ ng tr ng r , ết s c t m. Ở ức P8, P9, P10, n ở é ó í khuẩn l c nh 7 ầ ợ 55,12±0,21 , 54,4±0,35 , 48,82±0,45 mm. õ ệ sợi n ng, tiết s c t nh t. , ợng pepton t m C. militaris ở 35 g/L (P7). Kết qu củ W (2014) (2009) ổ y t o thể qu 5 / ó ể th , ợ ợc bổ sung trong n ứ ề 30 g/L. 3.2.1.1.5. T m ng MgSO4.7H2O ỡ ũ ó ở ớ ệ ủ ổ ợ adenosin. Theo Kang (2014), , , , S ới d ng KH2PO4 S 4.7H2 ó phầ ệ ể ợng cordycepin (Wen et al. 2014). P7 P10 P6 P2 P0 P5 P9 P4 P8 P3 P165 ể ứu ởng củ ợng MgSO4.7H2 i với sự ởng của hệ sợi n m C. militaris ế ứ ởng của hệ sợ ó ếu t nề ( í ệ 1 7), ng glucose t 25 / , m men t 35 / , 35 / ới d ợng MgSO4.7H2 : 0,5 g/L, 1,0 g/L, 1,5 g/L, 2,0 g/L lầ ợ í ệ M1, M2, M3, M4. T õ ự ởng của n m trong th i gian 15 ể ị ợng MgSO4.7H2O t Hình 3.18. Ảnh hƣởng của hàm ƣ ng MgSO4.7H2O đến sự sinh trƣởng của hệ s i nấm C. militaris Kết qu 3 18 cho th y hệ sợi n ở ở thức. Hệ sợi n m ng n, tr , ết s c t ng y. Sau 15 y: Ở ức M3, n ở é , í ớc khuẩn l c n m nh nh t 77,2±0,38 Ở ức M1 (0,5 g/L), í ẩn l c lớn nh t 84,1±0,47 , ợng MgSO4.7H2O t ần cho sự ởng của n 0,5 / T , (2010) ể y n m C.militaris cầnbổ ợng MgSO4. 7H2 0,02 / T , (2014) ổ sung 0,5g/L ớ ợ ó ứ ổ sung. 3.2.1.1.6.T m ng KH2PO4 ể ứu ởng củ ợng KH2PO4 i với sự ển khuẩn l c n m C. militaris ế ứ ởng của hệ sợ ng chứ ếu t nề ( í ệm 1.8), glucose t 25 / , m men t 35 g/L, pepton t 35 / , S 4.7H2Ot 0,5 / ới d ợng KH2PO4 : 0,5g/L, 1,0g/L, 1,5g/L, 2,0g/L lầ ợ í ệ 1, 2, 3, 4 T õ ự sinh ởng của hệ sợi n m trong th i gian 15 ể ịnh KH2PO4 ợng t Công thứ thí nghiệm M1 M2 M3 M4 7274767880828486M0M1M2M3 ƣờng kính khuẩn ạ (mm)Lô thí nghiệm66 m bằng m ng về ặ ể c t , ệ sợi n m. í ẩn l , é i kết qu sau 15 y. Hình 3.19. Ảnh hƣởng hàm ƣ ng KH2PO4 đến sự sinh trƣởng của hệ s i nấm C. militaris 3 19, ta th y sự ởng của hệ sợi n m ở ứ au. í ẩn l ần từ khi c ế í ớc, hệ sợi n m ng n, tr , ết s c t y. Sau 15 y: Ở ức K1, n ở é , í ẩn l t 84,3±0,4 Ở ức K3, n ởng m nh nh , í ẩn l c 89,3±0,61 , ó ổ sung 1,5g/L KH2PO4 n ởng t . S ớ ợng KH2PO4 bổ ng củ (2010) 0,5g/L, Huang et al. (2009) 1 / , W (2014) 0,1 / T (2014) 3 / ợng KH2PO4 t ể bổ sung của gi ng n m C.militaris NBRC 100741 ở mức 1,5 g/L. 3.2.1.1.7. T m ng vitamin B1 ể ứu ởng củ ợng vitamin 1 i với sự ển khuẩn l c n m C. militaris ế ứu sự ởng của hệ sợi n ng chứ ếu t nề ếu t ợc t í ệ , kết hợp với vitamin 1 ó ợ 0,5 / , 1,0g/L, 1,5g/L, 2,0g/L lầ ợ í hiệ V1, V2, V3, V4 T õ ự ởng của n m trong th i gian 15 ể ị ợng vitamin B1 t . Công thứ thí nghiệm K1 K2 K3 K4 82838485868788K0K1K2K3 ƣờng kình khuẩn ạ (mm)Lô thí nghiệm67 Hình 3.20. Ảnh hƣởng hàm ƣ ng vitamin B1 đến sự sinh trƣởng của hệ s i nấm C. militaris 3 20, ta th y ở ứ , ệ sợi n ở ó ự ệ õ ệt. Hệ sợi n m ng , ồng nh t, tiết s c t m. Sau 15 y: Ở ức V4, n ở é , í ẩn l t 85,97±0,37 Ở ức V2, n ởng m nh nh , í ẩn l c 89,86±0,48 , ó ổ sung 0,1g/L vitamin B1, n m C.militaris ởng t . S ới kết qu ứu củ c gi , n th ợng vitamin 1 ó ứu bổ ớ ợng của Liu (2009) (0,1g/L), g ợng vitamin B1 (0,05 / ) Huang et al. (2010) ổ sung. 3.2.1.1.8. T m ng nh ng tằm u Nhộng tằ ồn cung c ữ ọng cho sự ở ển của n m C.militaris. Nhộng tằ ợc xay nhuyễn, bổ ể g o lứ ng thu n lợ ể qu của n m. ể ứu nh ởng củ ợng nhộng tằ i với sự ển khuẩn l c n m C. militaris ế ứ ởng của hệ sợi n m ng chứ ếu t ỡ ợc t , ổ sung nhộng tằ vớ ợng 0g/L, 50g/L, 100g/L, 150g/L, 200g/L, 250g/L, 300g/L, 350g/L, 400 / , 450 / , 500 / í ệu lầ ợ 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 T õ ự ởng của n m trong th i gian 15 ể ị ợng nhộng t . V1 V2 V3 V4 8485868788899091V0V1V2V3 ƣờng kính khuẩn ạ (mm)Lô thí nghiệm68 Kết qu ứ ợc thể hiện ở 3 21 3 22. Hình 3.21. Ảnh hƣởng hàm ƣ ng nhộng tằm dâu đến sự sinh trƣởng của hệ s i nấm C. militaris Hình 3.22. Khuẩn ạ ủa nấm C. militaris ở á hàm ƣ ng nhộng khá nhau (tỉ lệ: 50mm) 3.21 3 22, ta th y sau 15 y, n ởng nhanh, hệ sợ ồng nh t, m ộ hệ sợi n ụ thể : í ủa khuẩn l ần ở ức N0 (56,42±0,45 ), 1(67,45±0,34 ), 2 (69,81±0,51 ) Ở ức N4, N5, N6, N7, N8, N9, N10, khuẩn l ó í ừ 68,54±0,25 – 70,5±0,03 , ớ í ớc khuẩn l c ở ức N0, N1, N2. Ở ức N3, n ởng m nh nh , í ẩn l c n 70,7±0,02 m. n th y, s c t của n m C. militaris m dần ở ức từ N0 ến N10. Công thứ thí nghiệm N5 N10 N6 N2 N4 N9 N8 N7 N3 N1 N0 01020304050607080N0N1N2N3N4N5N6N7N8N9N10 ƣờng kính khuẩn ạ (mm)Lô thí nghiệm69 Theo kết qu ứ , ợng nhộng tằ y n m C.militaris 150 - 200 g/L. T (1999) ợng nhộng bổ ể 23 / 142 / củ S (2006) ó ợng nhộng tằ ó ứu bổ 150 – 200 / , ó ự ầu s dụng của chủng n ở ển. y, sau khi t ó ần củ y, c tiế ồng t o thể qu n m C. militaris ể bột nhộng tằm (g o lứ nhộ ) ó ợ ng 3.4. Bảng 3.4. Hàm ƣ ng á hất bổ sung vào giá thể bột nhộng tằm TT Hóa hất/nguy n iệu Khối ƣ ng (g/L) 1 ng glucose 25 2 Cao n m men 35 3 Pepton 35 4 MgSO4.7H2O 0,5 5 KH2PO4 1,5 6 Vitamin B1 0,1 7 Nhộng tằ 150 8 ớc c t Bổ sung vừ ủ 1000 mL ều chỉ ng 7,0 1941, n cứu sự thể n m C. militaris t g o. Kể từ ó, ợc s dụ ộ ần chủ yếu cho sự sinh ởng thể qu củ ù th o (Li et al., 2006, Li et al., 2002; Wen et al., 2008, Z , 2003) t qu thể lớn nh ợc khi s dụng g o. Theo , (2006), í ợp nh ể ồ ù th ể bột nhộng tằm o lứ , i g o r ỡ ặc biệ sinh t ợng ó, ột s t hữ ó ể ợc s dụ ể ồng n m C. militarisbao gồm: bộ u, h , õ , h , , miế , , ũ , ớ ( , 2004; Z , 2006) T S , (2012) ũ ột s ch t hữ ợc chứ t t ể thay thế ùng. G o trộn với nhộng tằ ợc chứ t t ế ợc s dụ ồng (Jin70 , 2009, Z , 2006) ng chứ ù ợp cho sự thể (Yahagi et al., 2004) T ứ , ựa chọn s dụng g ứt với kh i ợng 25 / ( ể í 8 12 ) ế cho agar. 3.2.1.2. K t quả t u F F u t vậ ả g n sự r g, r ển c a n &. ar rr g ể bột nhộng tằm T ầ ể ợc s dụ ể y n m C. militaris gồ ợ ng , ợng cao n , ợ , ợng MgSO4.7H2 , ợng KH2PO4, ợ 1, ợng nhộng t , ( 3 4) o lứ (25 / ) ự ể ó í ớc 8x12cm, kh ù ở nhiệ ộ 121oC trong 25 , t 1 atm. ể sau kh ù ợ ể nguội, bổ sung 10 mL huyề ù ợi n m C. militaris ợ ng l ợc t (S Y) ặ m trong t i ở ều kiện nhiệ ộ t (20-25o ) ến khi hệ sợi phủ í ể. Chuyể í ệ ều kiện chiế T ế í ệ ởng củ ếu t nhiệ ộ, ộ ẩ , ến sự ởng của thể qu . 3.2.1.2.1. T m á , á n c a n m C. militaris T ầ ng t ( ng 3.4), bổ sung g o lứ 25 / ớ ể í ị ( ng 3.5). Bảng 3.5. Thành phần môi trƣờng giá thể nuôi ấy nấm C. militaris Thành phần môi trƣờng Công thức G1 G2 G3 G4 G5 G6 G7 G8 Thể í ng (mL) 30 40 50 60 70 80 90 100 G o lứt (g) 25 g S 5 , y hệ sợi n m ở ể hiện trong b ng 3.6. Bảng 3.6. ặ điểm hệ s i nấm trong á ình giá thể sau 5 ngày nuôi ấy Kí hiệu (*) ặ điểm hệ s i G1 Hệ sợi tr ng, m ộ hệ sợ , p phủ í ề mặ ể. Kết c ó t nhiều chỗ tr ng do bổ í ị , hệ sợ t dễ d G2 Hệ sợi tr ng, m ộ hệ sợ ể ớ ổ sung 30ml dung dịch. Kết c ó ều chỗ tr ệ sợ t dễ , ệ sợ p phủ í ề mặ ể.71 G3 Hệ sợi tr ng, ộ hệ sợ riể ớ ổ sung 40ml dung dịch. ết c ó ều chỗ tr ệ sợ t dễ , ệ sợ p phủ í ề ặ ể. G4 ệ sợi tr ng, ộ hệ sợ ể ớ ổ sung 50ml dung dịch. ết c t v ỗ tr ệ sợ t dễ , ệ sợ p phủ í ề ặ ể. G5 ệ sợi tr ng, ộ hệ sợ ể ớ ổ sung 60ml dung dịch. ết c t v ỗ tr ệ sợ t dễ , ệ sợ p phủ í ề ặ ể. G6 ũ ể bổ 70 ng, hệ sợi n m tr ng ịn, ộ hệ sợ ển nh. ết c t v kho ng t ệ sợ t dễ , ệ sợ ng x p phủ í ề ặ ể. G7 ệ sợi tr , p phủ í ề ặ ể. ết c ng t ng, hệ sợ ể t. G8 ệ sợi tr , p phủ í ề ặ ể. ết c ng t ng, hệ sợ ể t. ế 3 6 hi bổ sung 30 – 50 thể ó ứa 25g g o lứt, hệ sợi n ồng nh t, m ộ hệ sợi r , x p phủ í ề mặ ể. Kết c ó t nhiều kho ng tr , ệ sợi dễ ( 3 23) T , 2 ồng t o thể qu , thể í ng bổ sung từ 30 – 50 mL ứ ợc sự ởng thể qu . Hình 3.23. Hệ s i nấm tr n ơ hất ở ình giá thể bổ sung thể tí h 30-50 mL môi trƣờng A: h s mặ ; B: h s ng; 1: 30mL, 2: 40 mL, 3: 50 mL A1 B1 B2 B3 A2 A372 Khi bổ sung 60 – 80 ể. Hệ sợi n m tr ng mịn, m t ộ hệ sợ r ển m nh. Kết c t v ng tr ệ sợi t dễ , ệ sợ p phủ í ề mặ ể ( 3.24). Hình 3.24. Hệ s i nấm tr n ơ hất ở ình giá thể bổ sung 60-80 mL môi trƣờng A: h s mặ ; s ng; 1: 60mL, 2: 70 mL, 3: 80 mL Khi bổ sung 90 – 100 ể. Hệ sợi tr , p phủ í ề mặ ể. Do bổ sung một thể í ớn ch t l kh ù , hầ ng tr ng giữ t g ệ sợi chỉ ở ề mặ ể ( 3 25). Hình 3.25. Hệ s i nấm tr n ơ hất ở ình giá thể bổ sung 90-100 mL môi trƣờng A: h s mặ ; s ng; 1: 90mL, 2: 100 mL y hệ sợi n ủ tr ng bề mặt t, tiế , ộ 500 lx, th i gian chiế 12/24 gi , ộ ẩ í ộng 90%, nhiệ ộ 250 S 2 , ết qu ộ về kh ể qu thể hiện trong b ng 3.7. Bảng 3.7. Khả năng hình thành thể quả ủa nấm trong á ình giá thể sau 45 ngày nuôi trồng Kí hiệu (*) Khả năng hình thành thể quả G1 hể qu G2 ể qu G3 ể qu G4 ể qu , í ớ ợng thể qu ồ ều. G5 ể qu , í ớ ợng thể qu r ồ ều. G6 ể qu , í ớ ợng thể qu r ồ ều. G7 ể qu , í ớ ợng thể qu ồ ều. G8 ể qu A1 B1 B2 B3 A2 A3 A1 B1 A2 B273 ế 3 7 cho : Khi bổ sung 30 – 50 , ết c ó ng tr ng r t lớn, hệ sợi dễ ể ỡ ợc thể qu ộ ẩ t th , ổng hợ t cho sự ể qu bị ức chế ( 3 26 – G1, G2, G3). Hình 3.26. Cá ình nuôi không hình thành thể quả sau 45 ngày nuôi trồng G1, G2, G3, G7, G8: ổ sung lầ t 30 mL, 40 mL, 50 mL, 90 mL, 100 mL m ng Khi bổ sung 90 – 100 ể qu do hệ sợi chỉ ể ề mặ ể, hể t. Sau th i 2 ồng t o thể qu , hệ sợi bị i bề mặ ần ( 3 23 – G7, G8). Khi bổ sung 60 – 80 , ể qu ( 3.24). Trong giới h , ợng n ớc t ổ 70 ể qu ợc t o ra nhiề , í ớ ng của thể qu ồ ề y, với í ết kiệm t ồ ệ ầ n xu t, thể í ng bổ ợc lựa chọn 70 mL. Hình 3.27. Cá ình nuôi thể hình thành thể quả sau 45 ngày nuôi trồng G4, G5, G6: lầ t bổ sung 60 mL, 70 mL, 80 mL m ng 3.2.1.2.2. T m í ể ợc bổ sung gi ng n m C. militaris, chuyể ều kiệ ó , ộ ẩ í ộng 80 – 90% ể t o hệ sợi. Khi hệ sợi phủ í ề mặ ể, tiế ứu ởng củ ộ ẩ í ến kh ể qu của n m C. militaris. G4 G5 G6 G1 G2 G3 G7 G874 ợc b í ở ộ ẩ í : 50%, 60%, 70%, 80%, 90%; nhiệ ộ ồng 250C, ộ 500 lx. Kết qu ứu ợc thể hiện trong b 3 8 3 28. Bảng 3.8. Ảnh hƣởng của độ ẩm tới khả năng hình thành thể quả của nấm C. militaris tr n giá thể bột nhộng tằm Cá hỉ ti u theo dõi ộ ẩm (%) 50 60 70 80 90 Th mầm thể qu sau khi ( ) - 7 – 10 7 – 10 7 – 10 7 – 10 S ợng thể qu / - 8,50±0,12 22,85±0,34 146,60±0,21 147,09±0,61 Kh ợng thể qu / ( ) - 5,65±74 11,58±0,47 33,56±0,64 34,69±0,53 í ớc thể qu (chiề ng í ( )) - 41,75±0,26 3,49±0,11 57,22±0,13 3,47±0,25 75,34±0,56 3,46±0,85 75,47±0,27 3,46±0,11 ng thể qu - ụ, ù , hoặ ụ, ù , hoặ thể qu ó ụ, một s í thể qu ó ụ, một s í c thể qu - V m V m V m V m ợng adenosin (mg/g) - - 0,44 ± 0,02 0,46 ± 0,05 0,41 ± 0,03 ợng cordycepin (mg/g) - - 10,55 ± 0,41 10,56 ± 0,63 10,50 ± 0,74 Hình 3.28. Sinh trƣởng của thể quả nấm C. militaris ở á độ ẩm khá nhau tr n giá thể bột nhộng tằm75 Dự ết qu õ ồng thể qu ở ộ ẩ nhau kết hợp với s liệu b 3 8 3 25, nh n th ộ ẩ í t lớ ến kh ể qu của chủng n ứu, cụ thể : Ở ộ ẩm 50%, ể qu ộ ẩ 60%, ó ể qu s ợng thể qu , í ớ ng của thể qu ồ ều, thể qu ó ụ, ầu hoặc d ng kh ộ ẩ 70%, ể qu t ớ ồng ở ộ ẩm 60%, s ợng thể qu trung / 22,85±0,34, í ớ ng thể qu v ồ ều, thể qu ó ụ , ột s í ó ng kh d í ớ c của thể qu ồ ề ồng t o thể qu n ó ộ ẩm 80 – 90%. ợ ( í ể qu ) 0,46 10,56 mg/g ở ộ ẩm 70-80%; ở ộ ẩ 90%, ợng 2 ho t ch ó ều, lầ ợ 0,03 0,05 / ộ ẩm 70-90% kh ởng nhiề ế ợng ho t ch t. y, kết qu ứu cho th ộ ẩ í ng 80 - 90%, í ợp cho chủng n m C. militaris R 100741 ở , ể ể qu . Kết qu ũ ù ợp vớ ứu củ (F al., 2011, Zhang et al., 2010). ồng t o thể qu n ều kiệ o, cần b í ệ th ng , m b ộ ẩm trong kho ng 80 – 90% thu n lợi cho ể qu của n m. T ứu ởng củ ộ ẩ ến kh ể n m C. militaris, ó ứ c i tiế ộ ẩm nhằm m b ộ ẩ t 80 - 90% ( 3 29). Hình 3.29. Cá ƣớc tạo vi độ ẩm trong nuôi trồng tạo thể quả C. militaris ó a mẫ ã t hi n h s i; B: Bu í bằ m c; C: mẫ c x á o th qu A B C76 T ộ ẩ , ộ ẩ í ộng trong kho ng 80 – 90%, ở ộ ẩ t thu n lợi cho n ở ể qu . Khi chuyển giao ồng n m về ị ở ộ , ến t hữ í ừa tiết kiệ í ầ m b t ể qu của n m. 3.2.1.2.3.T ng c a nhi ợc b í ở ệ ộ : 70C, 150C, 200C, 250C, 300C, ộ ẩ 80%, ộ 500 , i gian chiế 12/24 gi . Kết qu cứ ợc thể hiện trong b 3 9 3 27. Bảng 3.9. Ảnh hƣởng của nhiệt độ tới sinh trƣởng, phát triển của của nấm C. militaris tr n giá thể bột nhộng tằm Nhiệt độ E0C) Cá hỉ ti u theo dõi 7 15 20 25 30 ặ ểm của hệ sợi Tr ng → cam Tr ng → cam Trằ → cam Trằ → cam Trằ → nh → chết Th thể qu ( ) - - 9 – 12 7 – 10 - S ợng thể qu / - - 122,86±0,45 145,39±0,61 - Kh ợng thể qu / ( ) 26,58±0,74 35,43±0,26 í ớc thể qu (chiề ng í ( )) - - 73,34±0,75 3,37±0,64 76,53±0,41 3,46±0,23 - ng thể qu - - ụ hoặc ụ hoặc - c thể qu - - V m V m - ợng adenosin (mg/g) - - 0,45 ± 0,03 0,46 ± 0,05 0,00 ợng cordycepin (mg/g) - - 10,54 ± 0,82 10,55 ± 0,79 0,00 Hiệu su thể qu (%) 0 30,27 ± 1,16 100 100 077 Hình 3.30. Sinh trƣởng thể quả nấm C. militaris ở nhiệt độ khá nhau tr n giá thể bột nhộng tằm Kết qu ở b 3 9 3 30 cho th y ở nhiệ ộ th p 70C 150C, hệ sợi n m chuyể ừ tr ể qu . Ở 300C, sau 2 – 3 , ệ sợi n ng chuyể T , do nhiệt ộ í ợp cho hệ sợi n ở ển, hệ sợi n m bị chết, ể qu . Khi nhiệ ộ ng 200C 250C í ợp cho hệ sợi n ở , ể ể qu , sau 2 – 3 , ệ sợi n m chuyển m , ể qu ở 250 ở 200 í ớc, kh i ợ ể qu của n m C. militaris ở 250C lớ ở 200C. Hiệu su ể qu thể hiện r õ, ở nhiệ ộ th p (7oC) hoặc cao (30oC), thể qu ợc t , ệu su ằng 0. Khi nhiệ ộ 15oC, hiệu su ể qu , 30,27%, ở kho ng nhiệ ộ 20 – 25oC, hiệu su t 100%. ợ ( ỉ í ể qu ) t 0,46 10,56 mg/g ở 20 – 25oC, ở nhiệ ộ 7, 15 30oC kết qu ằ 0 ó ự ể qu . y, kho ng nhiệ ộ í ợ y t o hệ sợ ể qu n m C. militaris 20 – 250 , ó ở 250 ệ ộ t . Kết qu củ ó ứ ũ ù ợp với kết qu ứu của một s ( al., 1995, Sato et al. (2002), Park et al., 2004, Shrestha et al., 2004, Fang et al., 2011, Keawsompong et al., 2009). 3.2.1.2.4. T ng c a á á * T á á ợc b í ớ ộ 500 ừ 2 nguồ ệ è è , nhiệ ộ ồng 250C, ộ ẩm 80 - 90%, th i gian chiế 12/24 gi . 7oC 15oC 20oC 25oC 30oC78 ế ứ ở ủ ế ể qu ủ C. militaris ợ ợ thể hiện trong b 3 10 3.28. Bảng 3.10. Ảnh hƣởng của ánh sáng đèn ompa t và ánh sáng đèn ed trắng n sinh trƣởng, phát triển của thể quả nấmC. militaristr n giá thể bột nhộng tằm Cá hỉ ti u theo dõi Ánh sáng đèn compací Ánh sáng đèn ed trắng Ánh sáng đèn LED màu ( m ó á á a ó á á 1 2) ặ ểm của hệ sợi Tr → Tr → t Tr → Th thể qu ( ) 7 – 10 7 – 10 7 – 10 S ợng thể qu / 145,73±0,21 80,63±0,35 100,20±0,54 Kh ợng thể qu / 33,54±0,19 20,57±0,28 24,52±0,40 í ớc thể qu (chiều c ng í ( )) 74,89±0,03 3,43±0,26 54,89±0,18 3,49±0,31 74,89±0,03 3,43±0,26 ng thể qu ụ, một s í ụ, một s í , ặ ó d ng kh i u ụ, một s í , ặ ó d ng kh i u c thể qu V m V t V ợng Adenosin (mg/g) 0,43 0,28 0,39 ợng Cordycepin (mg/g) 10,56 8,48 9,60 Hiệu su thể qủa (%) 100 86,25 ± 1,56 83,93 ± 1,52 T ế ợ ở b 3 10 3 31, hệ sợ ể qu ợ ớ è ó , ồng th , ợ dụ è , ó , ợng79 ho t ch t th ề ó ần khẳ ịnh ch ợ n ở ến ợ ó ể qu . ứ í ệ ồ ợ ế ằ è (500 ) ế ớ ứ ợ ế ằ è ng (500 lx) c về hiệu su , í ớ ợng thể qu ặc biệ ợng của 2 lo i ho t ch ể qu ợc t ớ è ầ ợ 153,57% 124,45% ới trong thể qu ợc t ớ è ng. * T ó á á ứ ầ , ộ ủ ở C. militaris ỉ ụ ộ ộ ế ụ ộ ớ ó g (Ren et al. (2014), Dong et al. (2013)) T ồ , , , ồ ( ó ớ ó ổ ợ ủ ớ ó (450 – 460 ) (620 – 630 ) ớ ỉ ệ ớ ó ứ 1/3 : 2/3 ) ế ể ổ ợ ( et al., 2013) T R (2014) ó ể ằ ừ è ó ợ í ợ ồ C. militaris, ồ ó ứ ũ ỉ ằ ợ ó ể ợ ế ụ ừ è ớ ự ộ ề : : : 6:3:1 Hình 3.31. Số ƣ ng và kí h thƣớ thể quả dƣới ảnh hƣởng của độ dài ƣớ sóng ánh sáng A- B í í m á á è LED; – th qu ều ki á ằ èn compact; C - th qu ều ki n chi á ằ è LED ( ó á á a ó á á 1 2); D- th qu ng ều ki á ằ è LED ng. B C D A80 Hệ sợ ể qu n m C. militaris ợ ớ è ó ồng th i, hiệu su t thể qu , ợ ẳn khi s dụ è ng hoặ ( ỉ ệ : 1:2), ó ợng ho t ch t th ề ó ần khẳ ị ớ ó ừ ồ ó ở ế c ợ ó ể qu . Theo Dong et al. (2013), ệ ợ ể C. militaris ụ ó ồ ( ồ 1/3 ù ó ớ ó 450 – 460 2/3 ù ó ớ ó 620 – 630 ) ệ ể ỉ ụ ( ớ ó 620 – 630 ) ặ ỉ ụ ( ) ( ớ ó 450 – 460 ) ế ợ ứ ũ ù ợ ớ ế ủ . (2013). , ồng n m C. militaris NBRC 100741 cần b trí ó hệ th ng chiế ằ è dụ è ặ è tr ng, vừa tiết kiệm v ầ ừa cho hiệu su ồ * T á á ệ sợ ợ ặ ớ ủ è pact vớ ộ : 100 lx, 200 lx, 300 lx, 400 lx, 500 lx, 600 lx, 700 lx, 800 lx, 900 lx, 1000 lx. Nhiệ ộ ồng 250C, ộ ẩm 80 – 90%. Kết qu ứ ợc thể hiện trong b ng 3.12 3 32. Hình 3.32. Sinh trƣởng của thể quả nấm C. militaris dƣới ƣờng độ ánh sáng khá nhau tr n giá thể bột nhộng tằm 200lx 300lx 400lx 500lx 600lx 700lx 800lx 900lx 1000lx 100lx81 Bảng 3.11. Ảnh hƣởng của ƣờng độ ánh sáng n sự sinh trƣởng, phát triển của thể quả nấm C. militaris tr n giá thể bột nhộng tằm Cƣờng độ ánh sáng (lx) Cá hỉ ti u theo dõi Thời gian hình thành thể quả (ngày) Số ƣ ng thể quả/ ình nuôi Hiệu suất hình thành thể quả (%) Khối ƣ ng thể quả/ ình nuôi (g) Kí h thƣớc thể quả (chiều ao x đƣờng kính (mm)) Hình dạng thể quả Màu sắc thể quả Adensin / cordycepin 100 7 – 10 25,09±0,18 10,35 ± 1,53 14,07±0,35 43,77±0,52 3,32±0,02 ụ hoặ ó ng kh i u V t 0,17 / 2,95 200 7 – 10 72,08±0,73 37,27 ± 1,01 21,05±0,52 52,08±0,08 3,28±0,03 ụ hoặ ó ng kh i u V t 0,25 / 3,58 300 7 – 10 112,16±0,20 69,15 ± 1,86 28,33±0,64 66,74±0,03 2,64±0,03 ụ , một s í ó ng kh i u V t 0,32 / 6,84 400 7 – 10 129,50±0,34 87,13 ± 1,03 34,78±0,02 74,08±0,03 2,46±0,02 ụ , ồ ều V m 0,38 / 7,96 500 7 – 10 147,71±0,67 100 34,96±0,21 75,10±0,03 2,42±0,02 ụ , ồ ều V m 0,40 / 8,32 600 7 – 10 148,01±0,12 100 35,01±0,37 76,63±0,03 2,35±0,02 ụ , ồ ều V m 0,41 / 9,27 700 7 – 10 146,35±0,78 100 34,60±0,75 76,14±0,03 2,48±0,02 ụ , ồ ều V m 0,47 / 10,53 800 7 – 10 145,67±0,06 100 34,08±0,32 75,48±0,03 2,47±0,02 ụ , ồ ều V m 0,45 / 10,57 900 7 – 10 151,36±0,84 100 34,59±0,83 76,02±0,03 2,50±0,01 ụ , ồ ều V m 0,46 / 10,54 1000 7 – 10 149,02±0,70 100 35,44±0,03 76,27±0,03 2,48±0,02 ụ , ồ ều V m 0,44 / 10,5582 ự ế ứ ở 3.11 3 32, ể ủ ủ C. militaris R 100741 ó ự ở ng ộ , ộ ng 700 – 1000 í ợp nh ể qu của n m. Kết qu củ í ệ ũ ù hợp với kết qu ứu củ (S , 1999, , 2000, Sato et al., 2002, Li et al., 2004, Zhao et al., 2006, Du et al., 2010, Sung et al., 2002, , 2011) ệ ể ề ệ ộ ế 100 (10,35%), ệ ầ ộ ế ầ , ặ ệ ở ộ ế 500 – 1000 lx, ệ ể 100% , ồ C. militaris ề ệ , ầ ế ế ó ệ ế ó ộ 700 – 1000 ệ ồ 3.2.2. Kết quả tối ƣu á yếu tố ảnh hƣởng đến sự sinh trƣởng và phát triển của nấm C. militaris tr n giá thể tự nhi n (tằm/nhộng tằm dâu) T í ệ ồng t o thể qu ù th o C. militaris ể tự ợc tiế ằ ộng tằ é i Thu (S ) ể ồ C. militaris ằ , ế ứ ủ ằ Từ ó, ó ù ợ ể ụ ằ ặ ộ ằ ể Tằ ó 4 ần lộ ( ằm ngủ), 5 th ( ổi tằm). Hết 5 tuổ ằ í , , é , ộng, biế Tằ ộng tằm r m, ch é ứa nhiề ( , 1, 2, , ), t (nh ), ợc s dụ ức ợc s dụ ể chữa một s bệ V y, s dụng tằm hoặc nhộng tằ ể y n m C. militaris vừ m b ầy ủ ch ỡng cho n ể ồng th ợc s n phẩ ù th o gần với tự t. 3.2.2.1. K t quả g r Fứu ơ g â ễm n m C. militaris t u o tằm/nhộng tằ Gâu Nhộng tằ ợc s dụ t chủ y n m C. militaris trong một s ứu (Hong et al., 2010). T ứ , dụng tằm/nhộng tằ é , i huyện Thu , ỉ S ng tằ ợ ó r83 chuẩn của T ứ ằm , ởi tằ ộ (S ), ằ ộng tằ m b o ch ợng vệ thực phẩ , ồ ó i cho sức kh i s dụng. Bảng 3.12. Ảnh hƣởng của phƣơng thứ ây nhiễm nấm C. militaris đến sinh trƣởng, phát triển của nhộng/tằm dâu Phƣơng thứ ây nhiễm Tằm sống hƣa kh trùng Nhộng tằm sống hƣa kh trùng Tằm đã kh trùng Nhộng tằm đã kh trùng Vị í mọc th qu 0 Vị í Vị í Vị í Kí c th qu (mm) 0 22,43±0,30 2±0,02 25,60±0,29 2±0,02 20,8±0,34 2±0,02 Kh ng th qu (g) 0 0,26±0,05 1,48±0,04 0,51±0,19 S ng th qu /con 0 4,71±0,12 3,73±0,16 3,87±0,16 T Vị í mọc th qu 0 Vị í / ỗ í Vị í / ỗ í Vị í / ỗ í Kí c th qu (mm) 0 28,68±0,23 2±0,02 26,78±0,23 2±0,02 17,45±0,27 2±0,02 Kh ng th qu (g) 0 0,35 ±0,04 1,53±0,07 0,19±0,22 S ng th qu /con 0 3,4±0,20 4,28±0,13 4,1±0,18 huyề ù hệ sợi n m Vị í mọc th qu 0 Kí c th qu (mm) 0 Kh ng th qu (g) 0 S ng th qu /con 0 * Tằm/nhộng s g ( ô g ử rù g): /â ễm n m C. militaris o g ể tằm s ng: Huyề ù ệ sợi n m C. militaris ợ ễ ằm s ng bằ 3 thứ : ằ , ới da.84 i vớ ứ ớ , ễ , ặt tằm trong ều kiệ ó , ệ ộ 250 , ộ ẩ í 80 – 90%. Ngay sau khi , ớ , ộ tằ ều chết. Sau 5 – 7 , ề mặt n m xu t hiện nhiều vi khuẩ m m c. Kết qu ứu thể hiện ở 3 33. Hình 3.33. Tằm không kh trùng ị nhiễm vi khuẩn, nấm mốc sau khi ngâm và ti m C. militaris i vớ ứ ễ ó , ở t t c ổi tằm, sau khi ó ề ù ệ sợi n m C. militaris, tằm v ở , ển , ế , ễm khuẩn, th í ở tuổi 4, tằm v ó nhộ , ó ết qu ó ể : (1) m C. militaris sinh ở ó í , , ệ ó của tằ t mức kiề y n m C. militari ở ợ ể của tằm s ng; (2) hệ sợi n m trong dịch huyề ù ợ ề mặt củ ó ể sẽ bị ổ ớ ệ ó ủa tằm. y, c 3 ứ ễm n m C. militaris o ể tằ kh ù ều cho kết qu ể qu . /â ễm n m &. ar o g ể nhộng tằm s ng: Huyề ù ệ sợi n m C. militaris ợ ễ nhộng tằ ng với 2 ứ ới da nhộng tằ 10 ổi. Nhộng tằ ợc ễ ợ ặ ều kiệ ó , ở nhiệ ộ 20 – 250 , ộ ẩm 80 – 90%. Nhộng tằ ợ y gi ng C.militaris chế 2 ~ 3 , ở cứng trong kho 7 , ệ sợi n m C. militaris í ộng tằm. ể t o thể qu , nhộng tằ ễm n , ợc chuyể ặc biệt, có ệ th ều chỉnh nhiệ ộ, ộ ẩ , ều kiện cần m b : ệ ộ ộng kho ng 23 – 250C, với ộ 700 – 1000 (12 , 12 ), ộ ẩ í 80 – 90%. Sau 2 – 3 ển nhộng tằ , ệ sợi n ng chuyển , 4 – 5 t hiện những thể qu ầ ệ ộ, ộ ẩm ộ ần tiếp tụ ợ ổ ịnh, 40 – 45 ợc thể qu85 C. militaris. Kết qu õ ề í ớc, kh ợ ợng thể qu trung / ộ ợc thể hiện ở b ng 3.12. Kết qu ng 3.12 cho th : T 2 ứ ễ ở , ển của n m C. militaris i vớ ức , ệ sợ ộng chỉ xu t hiện ở mộ ể ề mặt của nhộng tằ ( 3.45) t i vị í ỗ thở, t ó ể qu xu t hiện với s ợ 1, ữu mớ ó 2 ể qu , í ớ ủ ể qu 28,68 ợng thể qu / on t 0,35g. Vớ ứ ễ , ệ sợi xu t hiện phủ í ề mặt nhộng, s thể qu t / 4,71, í ớ ủa thể qu 22,43 i ợng thể qu / 0,26 y, mặ ù ợ ợc t í í ớ ợng thể qu ộng tằm ợc t ức ề ớ ức ặc biệt, thể qu ộng theo bằ ứ ể, trong khi thể qu ộng ức ng lẻo, dễ , ụng khi thu ho ch. Kết qu củ ứ y thể qu của C. militaris ó , trụ ộng 25-45 mm chiề , ự ặ ểm của thể qu trong tự n (Sung et al., 1996). Mộ ều cầ , ộng tằ ợc kh ù t dễ bị nhiễm n m m ẩn, hiệu qu của c 2 ứ ễ thể nhộng tằm s Hình 3.34. Kĩ thuật nuôi ấy nấm C. militaris tr n nhộng tằm dâu A1 – T m ề s ng tằm; A2 – H s i xu t hi ng theo ứ m; 3 - Th qu xu t hi ứ m B1 – N m ề s i; B2 – H s i xu t hi n thức m; B3 - Th qu xu t hi ức m A1 A2 A3 B1 B2 B386 * Tằm/nhộ g m ử rù g: - Ti â ễm n m &. ar o g ể tằ m ử rù g: ể ứ ứ ễm C. militaris t ằ ù ế ớ 2 ứ ễ ới da tằ Hình 3.35. Sinh trƣởng của nấm C. militaris tr n tằm đã kh trùng A - Tằm a ễm huyề s i n m; B – H s qu n m ằm Tằm ợ ễ ợc b o qu ều kiện t i ở nhiệ ộ 23 – 250 , ộ ẩm 80 – 90%. Kho ng 2 – 3 sau ặ ị , hệ sợi n ở í ể tằ ó ể õ, i với ứ iễ , ầu hệ sợi n ởng phủ í ề mặ thể tằ , ó ệ sợi tiếp tục s dụng nguồ ỡ ằ i với ứ ễ , ệ sợi n m s dụng nguồ ỡ tằ ể ởng, th i gian hệ sợi phủ í ề mặ ể tằm ch ới ứ ễ ể t o thể qu , tằ ễm n m C. militaris , ợc chuyển ra ớ ộ 500 (12 , 12 i), nhiệ ộ ộng kho ng 23 – 250C, ộ ẩ í 80 – 90%. Sau 2 – 3 ển tằ , ệ sợi n ng chuyể , 4 – 5 t hiện những mầm thể qu ầ ệ ộ, ộ ẩ ng ộ ợ ổ ịnh trong su rồng t o thể qu . Kho ng 40 – 45 ế ch thể qu ù th o. Theo kết qu õ ề í ớc, kh ợ ợng thể qu / ằ ợc thể hiện ở b ng 3.12, trong 2 ễ t triển của n m C. militaris Vớ ứ ễ , ợng thể qu / 4,28 í ớc ủ ể qu 26,78 ợng thể qu / t 1,53g. Vớ ứ ễm , ợng thể qu / 3,73, í ớc ủa thể qu 25,60 ợng thể qu / t 1,48g. A B87 y, ứ ễ ớ ó ệu su thức Thu thể qu n m C.militaris ể tằ é , í ợng adenosin T ểm nghiệm (Viện thực phẩm chứ ), ợc kết qu : ợng adenosin t 0,47mg/g chế phẩ , ợng t 16,83mg/g chế phẩ /â ễm n m &. ar o g ể nhộng tằ m ử rù g: ể ứ ứ ễm n m C. militaris t ộng tằ kh ù , ế ứu vớ 2 ứ ễ ới da nhộng tằ Nhộng tằ ợ ễ , ợc b o qu n ều kiệ ó , ệ ộ 20 – 250 , ộ ẩm 80 – 90%. Kho ng 2 – 3 sau ặ ị ể, hệ sợi n ở í ể nhộng tằm. ể t o thể qu , nhộng tằ ễm n m C. militaris , ợc chuyển ó ệ ộ 250 , ộ ẩ í 80 – 90%, ộ 700 – 1000lx, th i gian chiế 12/24 gi . Từ 2 – 3 sau khi chuyển nhộng tằ , ệ sợi n ng chuyển sang , 4 – 5 t hiện những mầm thể qu ầ T ếp tụ sự ổ ịnh của nhiệ ộ, ộ ẩ ộ ng 40 – 45 , thể qu ù th o ẩn thu ho ch (H 3.36). Hình 3.36. Số ƣ ng thể quả C. militaris tr n nhộng tằm đƣ ây nhiễm theo 2 phƣơng thứ ngâm (A) và ti m (B) Kết qu ứ ợc thể hiện ở b ng 3.12. T 2 ễm ển của n m C. militaris A B88 Vớ ứ ễ , ợng thể qu / 4,1, í ớc trung ủ ể qu 17,45 ợng thể qu / t 0,19g. Vớ ứ ễ , thể qu / 3,87, í ớc ủa thể qu 20,8 ợng thể qu / t 0,51g. S kết qu ễm n m C. militaris ộng tằ ù , nh n th ứ ễ ớ ó ệu su t th ứ Kết qu ũ ù ợp với kết qu ứu của Chen et al. (2002). y, dự ết qu í hiệ ợ , ó ứ ột s kết lu n về ễm n ằ ộng tằ : (1) ể tiế ễ m C. militaris ể tằm/nhộng tằ ó ể tiế 2 ứ ớ ễm C. militaris ằ ù ó ệu qu ộng tằm, cụ thể cao g p 3 – 7 lần. (2) Tằm/nhộng tằm cầ ợc kh ù ở nhiệ ộ 1210 , 15 ể lo i b vi sinh v , ị nhiễm vi khuẩ m m c, s n phẩ ù th ồ m b o vệ ề thực phẩ ợc phẩm. 3.2.2.2. ng c a tuổi nhộng tằ Gâu r g, r ển c a n m C. militaris Nhộng tằm 7-11 ổ ợc s dụ ể ịnh ởng tuổi của nhộng tằ ế ở , ển của n m C. militaris. Bảng 3.13. Ảnh hƣởng tuổi của nhộng tằm dâu đến việ hình thành thể quả nấm C. militaris Ngày tuổi Cá hỉ ti u theo dõi Thời gian hình thành thể quả (ngày) Số ƣ ng thể quả/con Khối ƣ ng thể quả/con (g) Kí h thƣớc thể quả (mm) Hình dạng thể quả Màu sắc thể quả 7 6 – 8 3,2±0,02 1,4±0,14 23,5±0,02× 2±0,02 ụ V nh t 8 6 – 8 3,8±0,04 1,53±0,21 25,0±0,05× 2±0,02 ụ V nh t 9 6 – 8 4,0±0,06 1,74±0,09 27,0±0,08× 2±0,02 ụ V m 10 6 – 8 4,0±0,06 1,74±0,12 27,5±0,12× 2±0,02 ụ V m 11 6 – 8 4,2±0,09 1,80±0,12 27,5±0,10× 2±0,02 ụ V m89 Kết qu ng 3.13 3 37 cho th y: - Ở ộ tuổ ở , ển với th ầm thể qu 6 – 8 , ng thể qu n ợ ề ụ - S ợng thể qu n ột con vớ ổ ó s ợng thể qu ộ 7 ổ ó ợng thể qu í t kho ng 3 thể qu , nhộ 8, 9, 10,11 ổ t kho ng 4 thể qu ột con. - Kh ợng thể qu ột con vớ ổ ầ ợ ần, cao nh ể qu ộ 11 ổi với 1,8 g lớ ộ 7 ổi 0,4 g. - Chiề ể qu ộ 11 ổi lớ ể qu ộ 7 tuổi 4mm; nhộ 8 ổi 2,5mm; nhộ 9 ổi 0,5 mm. Kh ợ , í ớ ệu su t thể qu ở 3 ộ tuổ ầ ệ ớn. Hình 3.37. Thể quả nấm C. militaris tr n nhộng tằm dâu ở á ngày tuổi khá nhau - c thể qu n ộ 9, 10, 11 ổ ới n m ộ 7, 8 ổ ở ể chọn nhộng tằ ó ộ tuổi từ 9 – 11 tuổ T T ằ ợc thể qu m b o về s ợ ợng. Kết qu n ứ ũ ồng với kết qu ứu về ởng của ộ tuổi nhộng tới kh ể qu của n m C. militaris của Hong et al. (2010). 3.2.2.3. K t quả g r Fứu ả ng c a nhi ộ, ộ ẩ , g ới khả ă g ể quả, ợng hoạt ch t c a n &. ar rr g ể tự r ( ằm/nhộng tằm) Dự ết qu í ệm của mục 3.2.2 1 3 2.2.2, ể nhộng tằm cho hiệu qu t o thể qu ớ ể tằ , y, từ ứ ỉ tiến ứu ởng của nhiệ ộ, ộ ẩ , ới kh ể 7 8 9 10 11 ổi íằ90 qu , ầ ợng ho t ch t của n m C. militaris ể tự nhộng tằ ù ộ ằ ợ kh ù ở nhiệ ộ 1210C, trong 15 p ể lo i b vi sinh v i, tiế ễm n ức B o qu n nhộng tằ ều kiệ ó , ệ ộ 20 – 250C. Sau 2 – 3 ễm, hệ sợi n í ể nhộng tằm, tiế chuyể ều kiệ í ệm về ởng của nhiệ ộ, ộ ẩ , ến sự ể qu . 3.2.2.3.1. ng c a nhi t i kh ă qu , ầ m ng ho t ch t c a n m m a á nh ng tằm ợc b í ở i nhiệ ộ : 70C, 150C, 200C, 250C, 300C, ộ ẩ 80%, ộ 500 , i gian chiế 12/24 gi . Kết qu ứ ợc thể hiện trong b ng 3.14 3 38. Bảng 3.14. Ảnh hƣởng của nhiệt độ tới khả năng sinh trƣởng, phát triển thể quả và hàm ƣ ng adenosin, cordycepin của nấm C. militaris tr n nhộng tằm dâu Cá hỉ ti u theo dõi Nháệt độ E0C) 7 15 20 25 30 Th ầm thể qu ( ) - - 8 – 10 6 – 8 - S ợng thể qu /con - - 4,63±0,25 4,75±0,10 - Kh ợng thể qu /con (g) - - 1,4±0,03 1,72±0,04 - í ớc thể qu (mm) - - 26,48±0,04 2±0,02 27,56±0,03 2±0,02 - ng thể qu - - ụ ụ - c thể qu - - V m V m - ợng adenosin (mg/g) - - 0,41 ± 0,17 0,42 ± 0,08 - ợng cordycepin (mg/g) - - 13,72 ± 0,86 13,81 ± 0,69 - Hình 3.38. Thể quả nấm C. militaris tr n nhộng tằm dâu ở dải nhiệt độ 7-30oC 70C 150C 200C 250C 300C91 Kết qu cho th y ở 70C 150C nhiệ ộ p, hệ sợi n m chuyể ừ tr ầm thể qu . Ở 300C, sau 2 – 3 , ệ sợi n ể T , ệ ộ cao í ợp cho hệ sợi n ởng ển, hệ sợi n m bị chế , ầm thể qu . Nhiệ ộ 200C, 250C í ợp cho hệ sợi n m ở , ể ể qu , sau 2 – 3 , ệ sợi n m chuyể , ầm thể qu ở 250C ở 200 í ớc, kh ợ ể qu n m C. militaris ở 250C lớ ở 200C. í ợng cordycepin của thể qu m u n m C. militaris y t o thể qu ở 200 250C. Kết qu ợ ở b ng 3.14 cho th y t i 200 250 ể qu ợng cordycepin , ự ệ ó ĩ ới t i nhiệ ộ 200C. ợ ( ỉ í ể qu ) 0,41 13,72 mg/g ở 20 – 250C, ở nhiệ ộ 7, 15 300C kết qu ằ 0 ó ự ể qu . y, kho ng nhiệ ộ í ợ y t o hệ sợ ể qu n m C. militaris 20 – 250 , ó ở 250 ệ ộ t Kết qu ũ ù ợp với kết qu ồ ể bột nhộng tằm ù ợp với một s ứ ớ ủ (F , 2011, w , 2009) ó ột s ứ ợc tiế ằm t ều kiệ y ể cho n m C. militaris. Hung et al. (2009) ếu t nhiệ ộ ế ợng cordycepin của n m C. militaris ó y nhiệt ộ 20 – 250C ệ ộ t ự ởng của n m C. militaris ợng cordycepin cao nh t ợi n ể qu . Nhiệt ộ 300C ức chế sự sinh ởng của n , ó ổng hợp cordycepin. Kết qu của ũ ự củ ó cho th y nhiệ ộ 250 ệ ộ t i y n m C. militaris. 3.2.2.3.2. ng c a m t i kh ă qu , ầ m ng ho t ch t c a n m NBRC 100741 á nh ng tằm ợc b í ở ộ ẩ : 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, nhiệ ộ ồng 250C, ộ 500 lx. Kết qu ứu ợc thể hiện trong b ng 3.16 3 39.92 Bảng 3.16. Ảnh hƣởng của độ ẩm tới khả năng hình thành thể quả của nấm NBRC 100741 tr n nhộng tằm dâu Chỉ ti u ộ ẩm (%) 50 60 70 80 90 Th ể qu - - 6 – 8 6 – 8 6 – 8 S ợng thể qu /con - - 2,38±0,05 4,67±0,18 4,66±0,37 Kh ợng thể qu /con (g) - - 0,57±0,51 1,69±0,26 1,69±0,74 í ớc thể qu (mm) - - 0,92±0,06 2±0,01 26,80±0,42 2±0,02 27,49±0,15 2±0,02 d ng thể qu - - ụ ụ ụ c thể qu - - V m V m V m ợng adenosin (mg/g) - - 0,41 ± 0,07 0,40 ± 0,10 0,38 ± 0,09 ợng cordycepin (mg/g) - - 13,70 ± 0,54 13,72 ± 0,31 13,24 ± 0,45 Hình 3.39. Thể quả nấm NBRC 100741 tr n nhộng tằm dâu ở á độ ẩm khá nhau Kết qu ứu cho th ộ ẩm ởng lớn tới kh ể qu của n m C. militaris, cụ thể : ở ộ ẩ 50% 60% ể qu ộ ẩm 70%, n ể qu í ớc nh . N ở , triể ể qu m nh nh t ở giới h ộ ẩ í ng 80 - 90%. 50% 60% 70% 80% 90%93 ợ ( ỉ í ể qu ) t 0,41 13,72 mg/g ở ộ ẩm 70 - 80%, ở ộ ẩ 90%, ợng 2 ho t ch ó ều l m. , ộ ẩ í 70 - 90% í ợ ể qu , cần b í ó ệ th ều chỉ ộ ẩ m b o hiệu qu kinh tế ồng. 3.2.2.2.3. ng c a á á ng c a th qu , ầ m ng ho t ch t c a n m NBRC 100741 á nh ng tằm * ng c a lo á á ợc b í ớ ộ 700 lx từ 2 nguồ biệ è è ng, nhiệ ộ ồng 250C, ộ ẩm 80 – 90%. ế ị ở ủ ế ể qu ủ C. militaris ợ ợ ể hiện trong b ng 3.16 3 40. Bảng 3.17. Ảnh hƣởng của ánh sáng đèn ompa t và ánh sáng đèn ed trắng n sự hình thành thể quả của nấm NBRC 100741 tr n nhộng tằm dâu Cá hỉ ti u theo dõi Ánh sáng đèn compact Ánh sáng đèn led trắng Th ầm thể qu ( ) 6 – 8 6 – 8 S ợng thể qu / 4,70±0,02 3,82±0,27 Kh ợng thể qu / ( ) 1,74±0,18 1,35±0,60 í ớc thể qu (mm) 26,87±0,23 2±0,02 21,46±0,54 2±0,03 ng thể qu ụ ụ c thể qu V m V t ợng adenosin (mg/g) 0,41 ± 0,09 0,28 ± 0,03 ợng cordycepin (mg/g) 13,72 ± 0,74 8,48 ± 0,87 Hình 3.40. Sinh trƣởng của thể quả nấm NBRC 100741 tr n nhộng tằm dâu khi nuôi trồng trong điều kiện ánh sáng đèn ed trắng (A) và ánh sáng đèn compact (B) A B94 T ế ợ , , ể qu củ 2 ức ề (6-8 ), , ức í ệ ồ ợ ế ằ è (700 ) ế ớ ức ợ ế ằ è ng (700 lx) c về hiệu su , í ớ ợng thể qu . ặc biệ ợng của 2 lo i ho t ch thể qu ợc t ớ è ầ ợ 146,42% 161,79% với trong thể qu ợc t ớ è ng. , ồng n m C. militaris R 100741 ể tự nhộng tằ ần b í ó ệ th ng chiế ằ è è ng, vừa tiết kiệm v ầ ừa cho hiệu su ồng lớn. * ng c a á á ợ ặ ớ ủ è ớ ộ : 100 lx, 200 lx, 300 lx, 400 lx, 500 lx, 600 lx, 700 lx, 800 lx, 900 lx, 1000 lx. Nhiệ ộ trồng 250C, ộ ẩm 80 – 90%. Kết qu ứ ợc thể hiện trong b ng 3.17 3 41. Hình 3.41. Thể quả nấm NBRC 100741 tr n nhộng tằm dâu khi nuôi trồng ở á ƣờng độ ánh sáng khá nhau ự ế ứ ở 3 18 3 41, ể ủ ủ C. militaris R 100741 ể nhộng tằ ó sự ở ộ , ộ ng kho ng 700 – 1000 í ợp nh ể qu của n m. Kết qu ứ ũ ồng với kết qu ứu về ởng củ ộ ới kh ể qu của n m C. militaris t o, n ở ển t ộ chiế 700 – 1000lx. , C. militaris ề ệ , ầ ế ế ó ộ 700 – 1000 ể ệ ồ 100 lx 200 lx 300 lx 400 lx 500 lx 600 lx 700 lx 800 lx 900 lx 1000 lx95 Bảng 3.18. Ảnh hƣởng của ƣờng độ ánh sáng n sự hình thành thể quả của nấm NBRC 100741 tr n nhộng tằm dâu Cƣờng độ ánh sáng (lx) Cá hỉ ti u theo dõi Thời gian hình thành mầm thể quả (ngày) Số ƣ ng thể quả/con Khối ƣ ng thể quả/con (g) Kí h thƣớc thể quả (mm) Hình dạng thể quả Màu sắc thể quả 100 6 – 8 2,07±0,05 0,75±0,64 14,26±0,17 2±0,03 ụ V t 200 6 – 8 2,85±0,74 0,95±0,29 16,44±0,05 2±0,02 ụ V t 300 6 – 8 3,56±0,83 1,34±0,20 22,18±0,48 2±0,02 ụ V m 400 6 – 8 4,35±0,48 1,57±0,50 24,42±0,38 2±0,02 ụ V m 500 6 – 8 4,68±0,39 1,71±0,04 27,03±0,02 2±0,02 ụ V m 600 6 – 8 4,68±0,01 1,70±0,28 27,02±0,16 2±0,02 ụ V m 700 6 – 8 4,70±0,27 1,73±0,25 27,74±0,18 2±0,02 ụ V m 800 6 – 8 4,69±0,04 1,71±0,49 27,29±0,04 2±0,02 ụ V m 900 6 – 8 4,69±0,09 1,70±0,01 27,30±0,06 2±0,02 ụ V m 1000 6 – 8 4,70±0,38 1,71±0,04 27,13±0,29 2±0,02 ụ V m96 3.2.2.4. Ng r Fứu x F ịnh gi ng tằ ù ợ F o g r Fứu uô rồng n m C. militaris NBRC 100741 ể ọ ợ ằ í ợ ồ C.militaris, ụ ằ ằ é ( ộ , S ) ằ é ( T , S ) Tằ é ợ ự ế ị , ó é ộ ự ế ứ ở , ự ọ ễ C.militaris ằ 2 ợ ộ ằ é ộ ằ é 3.42. ự ồ ộ ằ é ộ ằ é ợ ở 2 ệ ộ T ộ ỉ S , ó ứ : ộ ằ é ó í ớ ợ ớ ớ ộ ằ é , ộ ằ é ó ợ / 1,30±0,78 , ớ 1,78 ầ ớ ộ ằ é 0,73±0,52 Hình 3.42. Nhộng tằm dâu kén vàng (A) và nhộng tằm dâu kén trắng (B) m về kh ệ sợi, chuyển s c t , ự thể qu , í ớ ợng của thể qu 2 lo i nhộng tằm sau 45 – 55 y. Kết qu ứ ợc thể hiện ở b ng 3.19. Bảng 3.19. Ảnh hƣởng của giống tằm đến khả năng hình thành thể quả nấm NBRC 100741 Giống sị trí mọc thể quả Kí h thƣớc thể quả (mm) Khối ƣ ng thể quả (g) pố ƣ ng thể quả/con Nhộ é tr ng Vị í / ỗ í 22,34 ±0,28 x 2±0,02 0,33±0,09 4,02±0,15 Nhộ é Vị í / ỗ í 23,77 ±0,15 x 2±0,02 0,18 ±0,29 2,74±0,18 A B97 Kết qu b ng 3.19 cho th y: Giữa nhộng tằ é ộng tằ é , sự ển của n m NBRC 100741 S ết qu ở triển của n , n th y: T hộng tằ é ng, t ợng thể qu / 4,02 í ớc ủ ể qu 22,34 ợng thể qu / t 0,33g. N m NBRC 100741 ở ể ộng tằ é é S ợng thể qu / 2,74 í ớ ủa thể qu t 23,77 mm, kh i ợ ể qu / t 0,18g. Thu thể qu n m NBRC 100741 ể nhộng tằ é , í ợng adenosin ( ng chế phẩ ) T ểm nghiệm (Viện thực phẩm chứ ), ợc kết qu thể hiện ở b ng 3.20. Bảng 3.20. Hàm ƣ ng adenosin và ordy epin trong thể quả NBRC 100741 tr n nhộng tằm kén trắng và nhộng tằm kén vàng Hàm ƣ ng á hất Nhộng tằm dâu kén trắng Nhộng tằm dâu kén vàng Adenosin (mg/g) 0,41 ± 0,03 0,30 ± 0,01 Cordycepin (mg/g) 13,72 ± 0,16 16,05 ± 0,21 S ết qu í ợng adenosin ộng tằ é ộng tằ é , n th : ồng n m C.militaris nhộng tằ é ng cho thể qu ó ợ 0,11 mg/g, ợng cordycepin l i th 2,33 mg/g so với thể qu n ồng ộng tằ é T , ết hợp vớ í ớ ợng thể qu , ù ầu s dụng cầ ợ dụng nhộng tằ é ặc é ể y C. militaris ù ợp. * 6o u quả uô F &. ar rr g ể bột nhộng tằ ộng tằm tự r C. militaris ột nhộng tằm (mục 3.2.1), kết qu t ó ợng nhộng 200 g/L (200 con nhộ ), 1 ẽ s dụng 15 con nhộng nghiền nh , bổ m men, pepton, g o lứ , ợ 145 thể qu , ó ợ 35 / T ó, ết qu 3.2.2, 1 6 ộng, mỗi con xu t hiệ 2 - 3 thể qu , ó ợng98 7,5 / , é ề t, hiệu qu ột nhộng tằm cao ớ ộ Xé ề ợng ho t ch , 1 ớ ể bột nhộng tằ ó ợng 10,56 / × 35 369,6; 1 ể qu ộng tằ é ó ợng Cordycepin 13,72 mg/g × 7,5 102,9; 1 ể qu ộng tằ é ó ợ 16,05 / × 7,5 120,375 y, hiệu qu về ợng ho t ch t sinh họ ợc từ C. militaris ột nhộng tằm v n cao ớ ể nhộ Khi tiế C. militaris ở ớn, việ y C. militaris nhộng tằ dụng nhiều th , ức, do ó, ặ ù n phẩ ó ệu qu kinh tế l ớ ột nhộng tằm. Do v y, bột nhộng tằm v ể ế ồng C. militaris. 3.2.3. Kết quả xá định thời điểm thu hoạ h ông trùng hạ thảo C. militaris và ảo quản 3.2.3.1. Thu hoạch thể quả n m C.militaris Bảng 3.21. Chiều ao và hình dạng của thể quả C. militaris ở á thời điểm sinh trƣởng Sau khi xuất hiện thể quả Chiều cao thể quả (cm) Hình dạng đầu thể quả Màu sắc thể quả 2 tuần 1-2 Nhọ ầu V m 4 tuần 4-6 Nhọ ầu V m 6 tuần 7-8 Nhọ ầu V m 7 tuần 7-8 Nhọ ầu V m 8 tuần 7-8 Nhọ ầu V m 9 tuần 7-8 T ầu V t Kết qu ng 3.21 cho th , ớ ủ R 1000741, ủ ể ó ự ổ ừ ọ ầ ế ầ í Từ ệ ể , ầ ể ữ ọ ế í ớ 7-8 S ó, ầ ể ầ Kết qu của m i quan hệ ũ ỉ í ó ề ng hợp chiều cao của thể qu ỷ lệ thu n với th ởng.99 Bảng 3.22. Hàm ƣ ng adenosin và ordy epin trong thể quả ở á thời điểm sinh trƣởng khá nhau Hoạt chất Hàm ƣ ng á hoạt chất sau từng thời điểm sinh trƣởng tính từ khi xuất hiện thể quả 2 tuần 4 tuần 6 tuần 7 tuần 8 tuần 9 tuần Adenosin (mg/g ch t ) 0,16 ± 0,07 0,36 ± 0,06c 0,40 ± 0,03c 0,46 ± 0,02c 0,46 ± 0,02c 0,36 ± 0,01c Cordycepin (mg/g ch t ) 4,73 ± 0,15 7,74 ± 0,23d 9,12 ± 0,42d 10,56 ± 0,14d 10,56 ± 0,36d 7,58 ± 0,14d (c á ó ý ĩa a a á m m 2 ầ ; d á ó ý ĩa a á m m 2 ầ (p<0,05)) T ế 3.22, ợ ợ ó ự ổ ể ở í ừ ệ ể , ụ ể ợ í ớ ể ở , ợ í ớ ể 7-8 45-60 ng ( ừ 4,73 ế 10,56 / ; ừ 0,16 ế 0,46 / ) S í ớ ở , ầ ể ầ , ầ , ợ ợ ầ ( 7,58 / , 0,36 / ) , ể ể ù ợ í ớ ể 7-8 cm, sau 45-60 , ầ ể ọ , ó ( 3 43). Hình 3.43. Thể quả NBRC 100741 khi thu hoạch A – qu n thu ho ch; B – Th qu sau khi thu ho ch Dụng cụ thu ho ch: Khi thu ho ch ph ộ ũ, ẩu trang, s dụ , é ụ ể ể qu n m. + i với C.militaris ể bột nhộng tằm: ể qu ra kh thể, lo i b t p ch í ở ể qu . A B100 + i với C.militaris ể tự ( ằm hoặc nhộ ): ộ thể qu ể. + k thu , í ớc. S ẩ ẽ ợ ề 3.2.3.2. Bảo quản thể quả n m C.militaris n nh , ó ểm n dụ ợ ợng mặt tr i, tiết kiệm ch t, tiết kiệ ệ , th é , é , i nhiều diệ í , ó i quyế ợc kh ợng lớ ặc biệ ụ thuộ i tiết. ể chủ ộng trong việc b o qu n thể qu của n , dụ 2 o qu ng trong tủ s Bảo quản bằ g ơ g y trong t s y Thể qu của n ợc xế 1 ớ ( 3.44), ủ s y. Hình 3.44. ông trùng hạ thảo NBRC 100741 xếp tr n khay khi sấy ể ằ ọ ẩ ở ệ ộ ằ ( ) Bảng 3.23. Sự thay đổi khối ƣ ng, kí h thƣớ , màu sắc của thể quả NBRC 100741 sau khi sấy trong tủ sấy và đông khô (sấy thăng hoa) Chỉ ti u Sấy trong tủ sấy ông khô Tƣơi Sau khi sấy Tƣơi Sau khi sấy Kh i ợng (g) 100,00±0,20 21,63±0,24 100,00±0,13 20,05±0,21 ẩm (%) trong m u sau khi s y 8% 8% í ớc (cm) í 0,26±0,03 0,08±0,01 0,25 ± 0,02 0,25±0,02 Chiề 7,54 ± 0,17 5,58 ± 0,20 7,37 ± 0,21 7,37±0,19 c V V V ng cam V Tr ể qu Mềm, dai Cứ , Mềm, dai X p, dai101 Qua kết qu của b ng 3.23, theo c 2 o qu n, kh ợng của thể qu sau khi s y gi m kho ng 79 - 80% so với ở tr t mộ ợng lớn ớ nh s y. ó, ó ể ự ứ í ợng của m u : Kh ợ (g) = Do m ớ ều kiện nhiệ ộ th p, c ế ủa thể qu ị ởng, vì vậy kí h thƣớ (đƣờng kính và hiều dài) và màu sắc của thể quả vẫn đƣ c bảo toàn. T y trong tủ s y, nhiệ ộ m kh ợng thể qu , ợ ớc m ổ ộ ớc của tế p kho ng ữ ủa thể qu . Kết qu ổi, thể í ủa thể qu gi m, cụ thể, í m từ 0,26cm xu 0,08 , ề m từ 7,54 xu 5,58 T ể , ở c của thể qu ũ ổi từ ( 3 45). Hình 3.45. Hình thái ông trùng hạ thảo theo phƣơng pháp sấy truyền thống (A) và phƣơng pháp đông khô (B) Y ầu c ỉ s ù th : (1) Thể qu , ầu thể qu mở rộ , ù , 8-10 cm, í 2,0-3,0 , ó m m , ó p ch t. (2) Thể qu , ầu thể qu õ , ù , 6-8 cm, í 1,5-2,0 , ó m m , ó p ch t. (3) Thể qu , ầu thể qu õ , ù , 4-6 cm, í 1,0-1,5 , ó m m , ó p ch t. (4) Thể qu , ầu thể qu õ , ù , í 4 , ó m m , ó p ch t. S ẩ ù ợ ó ó , , ọ ủ … ụ , ó ể ữ ợ ẩ ề A B Kh ợ ( ) × 20 10102 K t quả â íF ợ g ForG FH aGH o Sau khi x bằ 2 y truyền th , ể qu của n m C.militaris ợ í ợ ết qu ợc thể hiện ở b ng 3.24. Bảng 3.24. Hàm u ng cordycepin và adenosin trong thể quả của nấm C. militaris theo phƣơng pháp sấy trong tủ sấy và đông khô Hoạt hất Sấy truyền thống ông khô 70oC 40oC Adenosin (mg/g) 0,28 ± 0,01 0,41 ± 0,03a 0,46 ± 0,02a Cordycepin (mg/g) 1,05 ± 0,02 10,27 ± 0,25b 10,56 ± 0,21b (a á ó ý ĩa a á 70oC; b á ó ý ĩa a á 70oC; p<0,05) ế í ở 3.24, ợ adenosin ể ể ớ ở ệ ộ 40o , 2 ứ ề ở ệ ộ ợ adenosin 60,87% ệ ộ ( ừ 0,46 0,28 / ) ặ ệ , ợ , ầ 10 ầ ớ ( ừ 10,56 1,05 / ) ớ ề T , ở 40o , ợ ể , ự õ ệ ề , ợ adenosin ở ể ó ể ẳ , ẩ ù ó ợ , ổ ị S ẩ ù , ợ ó ó , ( 3.46) ở ẻ ặ ụ Vớ ợ ù í ó ể ở 40oC. Hình 3.46. Sản phẩm ông trùng hạ thảo đông khô đƣ đóng gói và hút hân không103 Bảng 3.25. Hàm ƣ ng adenosin và ordy epin trong thể quả NBRC 100741 trong quá trình ảo quản Hoạt hất Hàm ƣ ng hoạt hất (mg/g hất khô) sau thời gian ảo quản (tháng) 0 1 3 6 12 18 Adenosin 0,46 ± 0,01 0,45 ± 0,10* 0,42 ± 0,09* 0,40 ± 0,11* 0,37 ± 0,03* 0,34 ± 0,02* Cordycepin 10,56 ± 0,18 10,53 ± 0,25# 10,49 ± 0,54# 10,37 ± 0,36# 10,05 ± 0,25# 9,83 ± 0,41# (* á ó ý ĩa a á m m á 0; (# á ó ý ĩa a Cordycepin á m m á 0; <0,05) ế 3.25 ch ợ ầ ề ệ 18 , tuy ứ ộ V ế í ệ ủ ề é ầ ó ề ự ổ ợ ủ ó í ế iều kiện ảo quản Hình 3.47. ông trùng hạ thảo iến đổi màu sắ sau 30 ngày trong điều kiện hiếu sáng Bảng 3.26. Sự thay đổi hàm ƣ ng hoạt hất trong thể quả ông trùng hạ thảo đông khô dƣới điều kiện hiếu sáng trong quá trình ảo quản Hoạt chất Hàm ƣ ng (mg/g) Ban đầu Sau khi chiếu sáng àm mất màu Adenosin 0,46 ± 0,01 0,03 ± 0,01* Cordycepin 10,56 ± 0,18 1,47 ± 0,03** (*, ** á ó ý ĩa ều ki n chi á i th m a ầu; p<0,05)104 Kết qu cho th ớ ụng củ , c củ ù th o biến ổi từ , è ó ợng s n phẩm gi m m , y ữ s n phẩ ệ , ể c è ện. ó, ó ể ó n phẩm trong v t , ếu qua. 3.2.4. Quy trình nuôi trồng ông trùng hạ thảo C. militaris ở quy mô Phòng thí nghiệm Chuẩn ị Thiết ị, d ng : ồ ù , ồ ù , ể , ệ ẩ ế, ổ ệ , ồ ự ộ , ộ ở ế ị ện, ủ -500 , ủ , ề ; , , , ó , , , Nguy n iệu: ộ ằ , ứ , C. militaris. Hóa hất: , , 2PO4, MgSO4.7H2 , , , ồ 90o, vitamin B1 glucose, kh , , 2O. Quy trình kỹ thuật  Bƣớ 1: Nuôi ấy và ảo quản giống nấm C. militaris NBRC 100741 1uô F y tạo nguồn gi g &. ar 1%5& 100741 rr ô r ờng PDA S ụ ( ) ể o nguồn gi ng C. militaris R 100741 ng th ĩ ữ gi ng trong ng nghiệm, ầ ủ : 20 g/L glucose (Scharlau, Spain), 200 g/L khoai , 20 / (S , S ), 1000 2O, pH = 7,0. ẩ ị ớ ế : 200 , ọ , , , 1000 ớ , , ế ớ , ổ ớ ủ 1000 ẩ ị ĩ : ổ 20 1 ị ế , ỉ ỗ ợ ế 7 0; ổ 20 , ế ế Ố ệ 1,5 ứ ằ 1/3 ể í ó V 500 ứ 300 ợ ệ ằ ớ , ụ í ù ồ ù (ở ệ ộ 1210 , 15 , 1 ) S ù , ệ ứ ợ ặ ; ó ợ ó ĩ ( ù ) ớ ể í 25 / ĩ ế ủ ọ ể ộ ợ ụ ể C. militaris.105 ù ù , ộ ầ ệ ợ C. militaris, ể ĩ ặ ĩ ề ệ ó , ệ ộ 250C. S 15 , í ớ ẩ 55 – 60 ể ầ , ị ễ , ế ể ( ể ) ệ ặ ệ ó ứ ề ệ ó , ệ ộ 250C. Sa 5 , ệ ợ í ề ặ ệ ứ ủ ầ ợ ở 40 ủ ề ị ỳ ừ 2 – 4 ộ ầ ể , C. militaris ợ ữ 10% ở -80o ằ (1) ù ù ộ ế ứ ệ ợ C. militaris ự ( ù ), (2) ù 0,3 ù ủ ế , (3) ằng parafilm, (4) , ủ , , (5) ặ (-1960C) ứ ồ ể ở -80oC.  Bƣớ 2: Nhân giống C. militaris NBRC 100741 trong môi trƣờng SDAY lỏng 1: ù ( ù ) ộ ầ ệ ợ C. militaris ( ữ ệ ) 125 S Y (20 g/L glucose (Scharlau, Spain), 5 g/L pepton (Scharlau, Spain), 5 / (Scharlau, Spain), 1000 mL H2 , 7,0; ù ồ ù ở ệ ộ 121oC, 1 , 25 , ể ộ ở ệ ộ ) ó V 250 , ụ , ổ ệ ở 25o , ộ 120 / , 120 , ợ 1 2: C. m a í má c ổn nhi t: ù ( ù ) 10 1 125 S Y ế 1 (25 g/l glucose; 5 g/l pepton; 5 g/l ; 0,5 g/l MgSO4.7H2O (Scharlau, Spain); 1,5 g/l KH2PO4 (Scharlau, Spain); 0,1 g/l VTM B1 (Pharbaco); pH = 7,0) ó V 250 , ụ , ổ ệ ở 250 , ộ 120 / , 120 , ợ 2 C. militar ng l n trong n m á (10 í ) ẩ ị 10 í S Y ế 1, ù ệ ự ộ ớ ù 25 ở 121o , ợ ế ợ106 , 100 ml 1. ở ộ ặ ẵ ( , ụ í ị ) S 5 , ợ 10 í ứ ầ ệ ợ C. militaris, ẵ ệ ể S ó, gi ng c 2 ợ ồng nh ồng nh t m u. M ộ ế ầ 2 105 FU ( / ) ể ế ệ ợ ể ộ ộ ằ  Bƣớc 3: Cấy giống Cordyceps militaris NBRC 100741 vào giá thể ị m á m militaris: 25 g ứ ủ í 500 ó 60 - 70 SDAY ng ế 2 (200 / ộ ằ ; 25 g/l glucose; 35 g/l pepton; 35 g/l men; 0,5 g/l MgSO4.7H2O; 1,5 g/l KH2PO4; 0,1 g/l VTM B1; pH = 7,0) ợ í ằ ù ở 121 25 , 1 at. Chu n bị á nh ng tằm : Lựa chọn nhộng tằ ừa mới c t kh é , ộp (100 con/hộ ), í , ù ở 121 25 , 1 at ể nguội. C m m a á : ù ù (V 12 ) 10 2 ó ớ ề ề ặ ể Hoặc s ụ ng d ó í 0,5 ù n ở (van x ể l y dịch trong nồ men) của nồ ự ộng, c y 10 mL huyề ù ệ sợi C. militaris ẩ ị ở ớ 2 (trong nồ ) ề ề ặ ể í i. ế ù C m m a ằm (1) ù ù (V 2 ) 0,1 ề ù ệ ợ C. militaris ( ợ ở ớ 2) ớ ộ ở ị í 1/3 ể í ừ ầ ộ ặ (2) ộ ề ù ệ ợ 20 ặ 6 / ủ ù V 500 , í ằ nylon. : ộ ằ ụ ợ ủ  Bƣớ 4: Tạo hệ s i ặ ể ( o hoặc nhộng tằ ) y huyề ù ệ sợi n m C.militaris trong t i (từ 5 - 7 ) ở nhiệ ộ 20oC - 25o ến khi xu t hiện hệ sợ ó ng phủ í ề mặ ể.  Bƣớ 5: Tạo thể quả ặt m ều kiện t ủ í ệ ặ ể ( ó ệ sợi C. militaris phủ í ) ó ứ 150 ớ ù ( ể t ộ ẩm từ 80% - 90%), ằ ớ ù , ữ chặt bằ107 ể ế ằ ng từ è ó 25W/0,5 2 ớ ế 12 : 12 , nhiệ ộ 25oC.  Bƣớ 6: Thu hoạ h và ảo quản Thu hoạch: Th i gian thu ho ch: kho 45 y gi ng. ặ ểm thể qu ó ể thu ho ch: Chiề t kho ng từ 7cm - 8 cm, ầu nhọ , ( ớc khi thể qu chuyể ầ , t dần). ĩ t thu: C ể qu , lo i b ể. T ị ó ể s dụng lo i C. militaris Bảo quản: Sấy khô ở nhiệt độ 40oC (trong tủ s ụng) ế , kh ợ t 20% so với kh ợ ầu) hoặc đông khô, rồ , ể ở nhiệ ộ 20 – 25o , Sơ đồ minh họa Bƣớc 2. Tạo nguồn giống Cordyceps militaris NBRC 100741 Gi ng c 1 ợ ng SDAY l ng trong tủ c vi sinh v ( 2) Gi ng c 2 ợ ng SDAY l ng trong tủ c vi sinh v t hoặc trong nồ ự ộng Bƣớc 3. Cấy giống n giá thể C y 10 mL huyề ù ệ sợi C. militaris ề mặ ể (g o lứt + nhộng tằ ) ợc chuẩn bị sẵ ( 4-5). Nhộng tằ ù ợ 0,1 ề ù ệ sợi C. militaris hoặ ền ù ệ sợi Cordyceps militaris 20 Bƣớc 4. Tạo hệ s i ặ u trong t i (5-7 ) ở nhiệ ộ 20oC - 25o ến khi xu t hiện hệ sợi Bƣớc 6. Thu thể quả và ảo quản (khi thể qu cao 7cm - 8 , ầu nhọn) C ể qu , lo i b ể ( i vớ ể o) hoặc giữ ( i với nhộng tằ ) S y ở 40oC hoặ , ó ó , , ể Bƣớc 5. Tạo thể quả , ế ng từ è 700 - 800 lx với th i gian 12/24 gi , nhiệ ộ 20 - 25o , ộ ẩm 80% - 90%, sau 7 - 10 t hiện thể qu Bƣớ 1. Nuôi ấy và ảo quản giống nấm C. militaris NBRC 100741 y t o nguồn gi ng C. militaris R 100741 o qu n ở 4oC108 Hình ảnh minh họa ớ 1 ớ 2 ớ 3 3.3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUI TRÌNH NUÔI TRỒNG NẤM Cordyceps militaris NBRC 100741 Ở QUI MÔ PILOT 3.3.1. Nhân giống nấm NBRC 100741 và cấy nấm C. militaris NBRC 100741 vào giá thể nhân tạo R 100741 chuẩn bị ể t í ệm: theo qui ẩn ở í ệm. R 100741 ể: S ụ 0 5 ù i vớ ầu ra của nồi , tra 10 ml huyền ù ệ sợi NBRC 100741 ( ẩ ị) c y ề bề ặ ể ế ù C u ợ ế ồng ở ểm: sau khi xu t hiện thể qu , sau khi xu t hiện hệ sợ y gi ng. ế ực nghiệm t ặt t i x , É (Thu , S ), T T (T ầ , ệ ), S (T , ) ể ó ều kiện th i tiế ( ệ ộ tr 9-11o ể 1-2, th í ó ữ ệt ộ xu ới -4o , ó , ế ; ặc 25-30o ể 4-5). Tuy , ế í ệm ở ( í ệ , ều kiện nhiệ ộ, ộ ẩ , ổ ị ều kiện t ) 3.3.2. Sự sinh trƣởng và phát triển của NBRC 100741 ở pilot sau khi xuất hiện thể quả tại phòng thí nghiệm ứ í ệ 1 (T 1): ợc c y gi ể, ặt m u trong t i (5-7 ) ở nhiệ ộ 20-25o ến khi xu t hiện hệ sợ %mßF %mßF %mßF109 700 - 800 lx, nhiệ ộ 20-25o , ộ ẩm 80-90%, sau 7-10 t hiện thể qu ớ ễn ra t í ệ ( S ó , T T c). Sau khi xu t hiện thể qu mớ ến pilot củ ị , ặ ều kiện chiế , ệ ộ, ộ ẩm t ( ng từ è , 700 - 800 lx, 25o , ộ ẩm 80-90%), õ ự ởng của thể qu . ợ ế ị 2 ểm th i tiế ể 4 ợ , X (03/01/2016), è T (06/3/2016, 07/5/2016, 16/7/2016) Qua 2 th ể õ ở , ển của C. militaris NBRC 100741, ợc kết qu trong b ng 3.27. Bảng 3.27. ặ điểm sinh trƣởng, phát triển của nấm C. militaris NBRC 100741 ở quy mô pi ot sau khi xuất hiện thể quả tại phòng thí nghiệm Công thứ thí nghiệm Công thức đối chứng Thời điểm Cá giai đoạn/ chỉ ti u theo dõi Pi ot Sơn La Pi ot iện Bi n Pilot Lai Châu Phòng thí nghiệm Co M É ông Xuân Hệ s i Thời gian 5-7 Mậ ộ, ộ x p , p Vị rí F a h sợi T ề mặt, ể 0 u ắc Tr ng, chuyển 2 Thể quả 7 ờ g a S 7-10 7ỷ xu ể uả (%) 95,54 ±0,27 6 ợ g/ % 168,36±0,53 168,45±0,56 168,51±0,47 167,15±0,73 167,35±0,21 . ợ g (g): 1 ể uả/ 1 0,36±0,04/ 34,64±0,50 0,37±0,06/ 34,17±0,34 0,36±0,04/ 33,43±0,49 0,36±0,17/ 34,35±0,75 0,37±0,06/ 34,24±0,17